温敏水凝胶搭载骨髓间充质干细胞对软骨缺损的修复

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1、中文摘要温敏水凝胶搭载骨髓间充质干细胞对软骨缺损的修复背景知识：软骨缺损的修复对医生和科学家来说是一个巨大挑战。由软骨缺损引起的关节疼痛和功能障碍给千万患者带来巨大的痛苦。由于软骨无血管的结构以及软骨细胞迁徙能力差，致使软骨很难自我修复。关节软骨为透明软骨，光滑而富有弹性，可以最大缓冲压力的吸收。临床常用的软骨修复方法是钻孔至软骨下骨或微骨折等骨髓刺激方法，旨在促进血液中的干细胞向病变部位聚集。然而，修复后的组织主要是纤维软骨，和透明软骨相比机械性能较低，并最终导致骨关节炎。如今对软骨再生较有前景的

2、方法为细胞治疗。软骨细胞起源于骨髓间充质干细胞（BMMSCs）。近年来由于种子细胞的自我复制和多向分化的能力，间充质干细胞被广泛使用。特别是BMMSCs因其微创方法便可提取，以及体外增殖容易而最接近临床应用。BMMSCs可保持稳定分化成软骨细胞的能力，是终生可用的软骨前体细胞。此外，与脂肪间充质干细胞相比，高密度的BMMSCs在三维培养中可明显促进产生软骨的分化。由于三维支架培养的BMMSCs可以促进软骨形成，多种生物材料已被开发用于软骨组织工程。在软骨中，II型胶原和蛋白聚糖形成三维结构，大部分由

3、液体填充，这类似于同样可以吸收大量水分的水凝胶三维网状结构。因此在过去的几十年，水凝胶在软骨再生领域处于重要角色，并将继续引领未来。特别是温敏水凝胶已备受关注，由于其独特的可注射性，在体温时溶胶-凝胶转变，无需任何其他的触发点。I合成温敏水凝胶可以控制它们的机械性能，对软骨修复的生物力学负载非常重要。聚丙交酯乙交酯（PLGA）是一种疏水性的官能聚合物，它具有良好的生物降解性及生物相容性，已被FDA批准可用于临床。最值得一提的是，PLGA的降解产物谷氨酸是关节软骨中含量最高的氨基酸。聚乙二醇（PEG）

4、是一种水溶性好、无毒的亲水性聚合物。基于这些聚合物，PLGA–PEG–PLGA三嵌段共聚物是具有良好的生物降解性和生物相容性，是一种有前途的温敏材料。材料与方法：在本研究中，我们通过PEG引发乳酸（LA）和乙醇酸（GA）的开环聚合制备了4种具有不同分子量的PLGA–PEG–PLGA三嵌段共聚物，并通过核磁共振氢谱、傅里叶转换红外光谱、凝胶渗透色谱、临界胶束浓度、透射电子显微镜、动态光激光光散射等一系列检测对上述共聚物以及其在水环境中完成自组装后所形成的高分子胶束表征了其化学结构和组成。通过小瓶倒置法

5、和流变实验研究了PLGA–PEG–PLGA的成胶性能。体外溶蚀实验和体内降解实验研究了其生物降解性能。噻唑蓝实验、细胞粘附和增殖实验来验证生物相容性及细胞生存增殖能力。选取雄性中国大白兔（2.5Kg）于膝关节股骨滑车处建造全层软骨缺损（直径5毫米，深度4毫米），将1×610BMMSCs与0.1mLPLGA–PEG–PLGA混合后移植至软骨缺损处，对照组移植物为0.1mLPLGA–PEG–PLGA水凝胶，空白组为软骨缺损未治疗。在移植12周后，大体观察软骨缺损修复效果，并通过H&E染色、免疫组化、甲苯

6、安蓝染色等评定修复效果，并对新生软骨II型胶原及糖胺多糖定量分析，以及检测其生物力学性质。结果：利用辛酸亚锡作为催化剂，PEG作为大分子引发剂引发LA和IIGA的随机开环聚合合成PLGA–PEG–PLGA三嵌段共聚物，并充分验证了其化学结构。聚合物PLGA嵌段的数均分子量分别为1600g-1-1-1-1mol，880gmol，1400gmol，1750gmol，LA/GA(mol/mol)均-1-1为75:25。四种聚合物的CMC数据分别为6.6mg·L、4.2mg·L、2.0-1-1mg·L以及1

7、.2mg·L。胶束的流体动力学半径分别为32.1±6.9nm、76.3±5.45nm、95.6±7.89nm、148.7±10.13nm。4种凝胶（20wt%）磷酸盐缓冲液（PBS）在低温（4°C）时为液态，除聚合物2外，其余3种聚合物PBS溶液在37°C时转变为凝胶。流变学实验证实了其较强的机械性能，温敏水凝胶G′值达到3kPa，凸显了这种材料作为可注射水凝胶作为软骨组织工程的潜能。凝胶在体外和体内均可降解，但体内的降解速率比体外快。噻唑蓝实验72h的细胞存活率>90%，具有较好的生物相容性。细胞

8、粘附及增殖实验检测细胞在凝胶表面相对粘附率超过50%，在水凝胶内部培养21天表现高达数倍的相对增殖率，证实了所制备的水凝胶具有优良的细胞粘附和增殖能力。在混合物移植后12周观察发现再生软骨与周围正常软骨及软骨下骨结合完好。免疫组织化学染色和甲苯胺蓝染色及生化分析证实了新生软骨中Ⅱ型胶原和糖胺多糖的沉积。纳米压痕试验证实了新生软骨生物力学性能接近于透明软骨。结论：PLGA–PEG–PLGA温敏型水凝胶可以作为一种良好的可注射生物材料应用于组织工程等领域，其作为BMMSC