沙眼衣原体质粒蛋白porf5引起的宿主差异蛋白的筛选及功能初步研究

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2、师、职称：李忠玉教授；ｓｉ禱測．＾攝，‘、．；：学科专业；細医学；謂；韻雲轨，’―研究方向，：病腾学；囉，，：觀；：編＊為拳＇警所．学院：医学院Ｓ違雖．ｅ，ｆ，参－．勢．＞Ｖ顧龜嚇，哪禁禱酶参．—二。－五年五月；－＾ｒ；．她蠢識寒思１＇’吟．条，新：：於藤：巧，Ｉ；雜讓矿三＾带纖＊的薄辦讓詞纖義邏沙眼衣原体质粒蛋白ｐ〇ＲＦ５引起的宿主差异蛋白的綿选及功能初步研究论文作者签名；聲是斗３？ｆｆ指导教师签名？寺（ｒ皆论文评阅人１：曾铁兵，教授，硕导，南华大学医学院评阅人２；曾嫁华，教授，硕导，南华大学睽学院

3、评３；阅人答辩委：员会主席，博导，也万康林，研究员中国疾病预防控制中委１：员尹跃平，研究，，员博导中国医学科学院巧肤病研究所；委员２，，南华大学医学朗四海，教授硕导院委３：员朱翠，，明，教授硕导南华大学医学院委４员：，，硕导周洲副教授，南华大学医学院委５；员６；委员：２０１５年５２３答辩日期月日沙眼衣原体质粒蛋白pORF5引起的宿主差异蛋白的筛选及功能初步研究摘要：沙眼衣原体（Chlamydiatrachomatis，Ct）pORF5（pgp3）是由质粒基因编码的唯一一种分泌到宿主细胞胞浆中的分泌性质粒蛋白，与毒

4、力密切相关，但pORF5在Ct致病过程中的分子机制和功能还不甚明了。本研究试图探讨在Ct致病过程中与质粒蛋白pORF5相互作用的宿主蛋白及其功能，为深入研究Ct的致病机制提供实验依据。构建pORF5基因慢病毒表达载体，与辅助质粒共转染HEK293T细胞包装慢病毒颗粒，收集慢病毒后感染HeLa细胞，流式细胞技术多次分选筛选阳性细胞克隆，获得pORF5基因稳定转染的HeLa细胞系（pORF5-HeLa细胞系）和对照HeLa细胞系，实时定量PCR（qRT-PCR）和Westernblotting分别鉴定pORF5的mRNA和蛋白表达水平。采用同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ

5、）技术结合二维液相色谱串联质谱（2DLC-MS/MS）技术建立pORF5-HeLa细胞系和对照HeLa细胞系的全细胞蛋白表达谱，构建差异蛋白表达数据库；qRT-PCR验证部分差异蛋白mRNA的表达水平。应用DAVID在线生物信息学分析软件、在线STRING软件分析和在线KEGGPATHWAYDatabase软件分析等生物信息学方法对差异蛋白进行GO（基因本体）分子功能注释、蛋白质相互作用及KEGG信号通路分析，预测差异表达蛋白生物学功能。构建高迁移率族蛋白B1（HMGB1）基因RNAi慢病毒表达载体，利用三质粒慢病毒包装系统生产shRNA-HMGB1病毒，收集病毒上清，并

6、感染HeLa细胞，建立稳定干扰HMGB1表达的pORF5-HeLa细胞系及空白载体转染的对照细胞系；采用qRT-PCR和Westernblotting检测自噬相关蛋白Beclin-1和LC-3的表达；采用流式细胞仪检测检测细胞凋亡率和细胞周期。本实验研究结果如下：1.成功建立了稳定过表达pORF5的HeLa细胞系和对照细胞系；2.采用iTRAQ标I记结合2DLC-MS/MS质谱技术共鉴定了314个差异表达的宿主蛋白，其中159个蛋白表达上调，155个蛋白表达下调。GO功能注释显示：差异蛋白的功能主要涉及分子功能、细胞组分功能和生物学进程功能三方面。分子功能方面包括：①蛋白

7、结合转录因子功能，如核仁磷酸蛋白、RNA聚合酶Ⅱ激活因子p15等；②核酸结合转录因子功能，如高迁移率族蛋白B1、高迁移率族蛋白B2等。细胞组分功能方面包括：①参与细胞分裂增殖，如氯离子通道蛋白1、膜联蛋白A1等；②参与细胞连接，如α-辅肌动蛋白-4、整合蛋白α-6等。在生物学进程功能方面：部分差异蛋白参与细胞繁殖过程，如运铁蛋白受体蛋白-1、60S酸性核糖体蛋白P2等；部分差异蛋白参与细胞免疫反应过程，如补体C9、补体衰退加速因子等；部分差异蛋白参与细胞死亡，如角蛋白、抑制蛋白-1等。STRING软件分析结果显示：各差异表达蛋