那曲冬虫夏草菌株的分离、发酵及虫草多糖免疫功能评价

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1、AGRICULTURALUNIVERSITYOFHEBEI硕士学位（毕业）论文那曲冬虫夏草菌株的分离、发酵及虫草多糖免疫功能评价学位申请人：郭洁指导教师：袁洪水副教授朱宝成教授学科专业：微生物与生化药学学位类别：理学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二O—五年五月三十日分类号：Q939.9单位代码：10086密级：公开学号：2012081那曲冬虫夏草菌株的分离、发酵及虫草多糖免疫功能评价Separation、fermentationofCordycepsstrainsfromNaquandevalvationofimmunologicalCordycepsPoly

2、saccharide学位申请人：郭洁指导教师：袁洪水副教授朱宝成教授学科专业：微生物与生化药学学位类别：理学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一五年五月三十日独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研宄成果，也不包含为获得河北农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研宄所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：年&月工曰学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解河北

3、农业大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河北农业大学可以将学位论文的令部或部分内容编入有关数据库讲行检索，可以釆用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：导师签名：签字mw:年(月曰签字曰期：>WJ�年<月』曰学位论文作者毕业后去向：工作单位：电话:通讯地址：邮编:摘要冬虫夏草是一种名贵中药材，由于其特殊生长条件，加之人们的过度采挖，造成冬虫夏草这一珍稀资源更加缺乏。本研究旨在得到一株高产多糖的冬虫夏草菌株来扩展这一珍贵资源

4、。对采自西藏那曲地区高山草甸的新鲜冬虫夏草子实体进行分离，得到50株大小、形状、颜色各异的菌株，运用插片法观察菌丝体和孢子形态特点发现，CC-2、CC-3、CC-4、CC-5、CC-9、CC-10菌株的菌丝和孢子形态与虫草菌株结构相似。经分子生物学鉴定CC-2菌株与拟青霉（Simplicilliumsp）的相似性为97.80%，CC-3与枝孢菌（Cladosporiumsp）的相似性高达100%，CC-4菌株与麦角菌（Claviciptitaceaesp）的相似性为99.76%，CC-5菌株与黑粉菌（Unculturedustilago）的相似性为99.83%，CC

5、-9菌株与黑粉菌（Ustilaqinoideavirens）的相似性高达100%，CC-10菌株与轮枝菌属（Verticilliumsp）的相似性为97.17%。选取菌落洁白、生长旺盛、菌丝健壮的分离菌株CC-3进行发酵培养基和发酵条件优化，单因素和正交试验结果显示，以蛋白胨为氮源，多糖含量为0.686g/L，以麦芽糖为碳源，多糖含量最高为0.786g/L。采用正交试验，最优无机盐配比为KH2PO40.1g、MgSO40.05g、ZnSO40.05g时，多糖含量可达1.550g/L。最优发酵条件为发酵温度为30℃，接种量为10%，多糖含量最高，可达2.180g/L。

6、以CC-3菌株为试验材料，以多糖得率为指标，正交试验比较热水浸提法和超声波辅助热水浸提法提取虫草胞内多糖工艺研究，热水浸提法的最优条件为提取温度90℃，料液比1:30，时间60min，提取次数4次，多糖得率为2.265%。超声波辅助热水浸提法提取多糖的最优条件为开停时间3:7，超声时间90min，超声次数4次，多糖得率最高为6.619%。后者比前者多糖得率高2.9倍。以CC-3菌株为供试菌株，50只肉鸡为试验材料，随机分成3组，对照组、1%剂量添加组和2%剂量添加组。对其进行免疫器官指数、H.E免疫组织切片染色和肠道微生物菌群的研究。从试验结果看，7-14d时试验组

7、与对照组，胸腺生长缓慢，21d时生长迅速，28d开始胸腺指数有所降低，胸腺开始退化。法氏囊35d后开始退化，试验组与对照组差异显著（P<0.05），明显降低了胸腺和法氏囊的退化程度。脾脏一直在增加，试验组与对照组差异显著，试验组脾脏指数明显增加。HE切片可以看出，与对照组相比，试验组的脾脏和法氏囊均无明显变化，切片组织正常。对照组脾脏红、白髓界限不明显，周围淋巴鞘也不明显，添加虫草多糖的试验组与对照组相比，淋巴细胞较密，脾脏发育较对照组好。法氏囊切片看，对照组皮质较少，淋巴细胞较疏，添加虫草多糖的试验组与对照组相比，淋巴细胞较密，皮质较厚，试验组发育良好。肉鸡肠