糖氧剥夺复氧复糖下大鼠星形胶质细胞cx43的变化及其机制

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1、前言前言缺血性脑卒中急性期最有效的治疗是通过动静脉溶栓及时恢复缺血区域的血液再灌注，但其严格的时间窗及出血风险等导致仅有不到3%的患者接受溶栓治疗，只能采取内科保守治疗。脑内血管闭塞后，脑组织缺血中心区会形成梗死灶，而周围的缺血半暗带是一个动态的病理生理过程。梗死灶区域的垂死细胞会释放有害物质、传递死亡信号，并逐渐扩散到缺血半暗带，造成梗死体积的扩大，这些有害物质的传播可能与广泛分布于中枢神经系统的缝隙连接（gapjunction,GJ）有关。星形胶质细胞上缝隙连接蛋白43（connexin43

2、,Cx43）是构成GJ的最主要成分，它的变化影响星形胶质细胞的功能，进而在缺血性脑卒中的发展过程中发挥作用，多年来针对Cx43为主的缝隙连接蛋白表达水平的调控一直在不断的研究探讨中。缝隙连接斑中央的部分或整个缝隙连接通道以双层膜的形式被转运入细胞内，这种结构与胞吞的囊泡类似。Cx43的C-末端是主要的磷酸化区域，它受多种激酶的影响，包括蛋白激酶C（proteinkinaseC,PKC）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogeactivatedproteinkinases,MAPKs）、Src激酶等，其

3、中Ras-Raf-MEK-ERK通路最受关注，在信息传递过程中起关键作用。细胞内蛋白的降解主要通过自噬溶酶体和泛素-蛋白酶体系统途径；自噬的调节是一个相当复杂的过程，Beclin1在自噬体的形成过程中是必需的，能够介导其它自噬蛋白定位于吞噬泡，在自噬过程中它的表达水平往往会上升。本实验采用体外培养大鼠星形胶质细胞糖氧剥夺/复氧复糖模型模拟在体缺血性脑卒中，观察星形胶质细胞的Cx43在数量和结构上发生何种变化，并分析其可能的机制。III中文摘要中文摘要糖氧剥夺/复氧复糖下大鼠星形胶质细胞Cx43的

4、变化及其机制背景：神经血管单元包括神经元、神经胶质细胞和血管内皮细胞，这强调了其作为一个整体维持脑正常功能的重要性。星形胶质细胞作为维持神经血管单元功能的关键环节，广泛存在着由缝隙连接蛋白43(connexin43,Cx43)构成的缝隙连接通道，它形成细胞间重要的信息传递通路。缺血性脑卒中是由于脑血流中断破坏局部脑组织的能量供给，导致神经血管单元功能障碍，此时Cx43必然发生相应的变化。Cx43在其生命周期中受多种因素的调节，其向细胞内转运及降解的途径不甚清晰。而且Cx43作为胞膜蛋白，向细胞质

5、内的转运是否与胞吞作用有关尚不明确。Cx43在合成过程中是借助微管运输系统被转运到细胞膜上的，那么它向细胞质内的转运是否也与微管运输有关有待于进一步研究。细胞内蛋白的降解主要通过自噬溶酶体途径和泛素-蛋白酶体系统途径完成，Cx43向细胞质内的转运可以被脑缺血激活，通过活化蛋白激酶信号通路，改变磷酸化状态，最终使其发生降解，影响缝隙连接胞间通讯的功能，但具体机制目前并不明确，这也成为该领域的研究热点。目的：观察大鼠星形胶质细胞Cx43在糖氧剥夺/复氧复糖（ischemia/reperfusion;

6、oxygen-glucosedeprivation/reoxygenation;I/R）条件下数量和质量方面的变化规律，并进一步探讨其变化的机制。方法：采用连续传代法体外纯化培养大鼠星形胶质细胞，通过调节培养箱参数及更换无糖培养液建立其I/R模型。糖氧剥夺2h后，分别复氧复糖0.5h、1h、3h、6h、12h、24h、72h，采用Westernblotting方法对Cx43进行定量分析，通过Westernblotting及RT-PCR方法分析EB1在蛋白和基因表达量方面的变化。使用MTT比色法选

7、择细胞损伤最重的时间点，设立正常培养组、I/RSaline对照组、I/R甘珀酸干预组，采用激光共聚焦显微镜观察Cx43分布的变化；dynasore阻断胞吞作用后，再次于激光共聚焦显微镜下观察Cx43的分布变化。同时，设立正常培养组、I/R组、I/RTPA组、I/RMG132组、I/RTPA+MG132组，采用WesternV吉林大学博士学位论文blotting方法对p-Cx43（Ser368）、p-ERK1/2、Beclin1蛋白进行定量分析。结果：(1)成功建立了星形胶质细胞纯化体系及其糖氧剥

8、夺/复氧复糖模型。（2）Westernblotting结果提示I/R后各个时间点的Cx43总量并未发生改变（P>0.05）。（3）MTT法提示I/R后6h细胞受到的损伤最严重，此时使用激光共聚焦显微镜观察发现Cx43发生了内在化，即细胞膜上分布减少，而细胞质内分布增多(P<0.05)。（4）甘珀酸阻断缝隙连接后，并不影响Cx43的表达量(P<0.05)。（5）Dynasore可以部分性抑制Cx43的内在化，较对照组相比，Cx43的内在化减少了29.2%（P<0.05）。（6）EB1的蛋白和基因相