猪札幌病毒主要非结构蛋白的表达及vp2互作分子的筛选

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1、密级：.论文编号：中囯农业科学院学位论文猪札幌病毒主要非结构蛋白的表达及VP2互作分子的筛选ExpressionofMajorNonstructuralProteinsofPorcineSapovirusandScreeningofProteinsInteractedwithVP2硕士研宄生：单兴娜指导教师：兰喜副研宄员申请学位类别：兽医硕士专业领域名称：兽医培养单位：兰州兽医研究所研宄生院2015年5月密级:论文编号:中国农业科学院学位论文猪札幌病毒主要非结构蛋白的表达及VP2互作分子的筛选Expression

2、ofMajorNonstructuralProteinsofPorcineSapovirusandScreeningofProteinsInteractedwithVP2硕士研究生：单兴娜指导教师：兰喜副研究员申请学位类别：兽医硕士专业领域名称：兽医培养单位：兰州兽医研究所研究生院2015年5月Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationExpressionofMajorNonstructuralProteinsofPorcineSapov

3、irusandScreeningofProteinsInteractedwithVP2M.S.Candidate：ShanXingnaSupervisor：AssociateProf.LanXiDegree：MasterofVeterinarianSpecialty：VeterinarianMay2015独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育

4、机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年月日关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日摘要札幌病毒又名札如病毒，属于杯状病毒科札幌病毒属，

5、是人和动物病毒性急性胃肠炎的主要病原体之一。主要通过粪-口途径传播，引起轻微腹泻或急性腹泻并伴有恶心、呕吐和腹痛等症状。近年来研究发现，札幌病毒不仅感染人，而且感染猪、牛、狗、猫、蝙蝠、水貂和海狮等动物。猪札幌病毒最早于1980年在美国被发现，随后，在许多国家都发现了该病毒，给养猪业造成了一定的威胁和损失。中国最早于2008年从腹泻猪的粪便中分离出了该病毒，随后的研究发现，该病毒不仅存在于腹泻猪群中，而且在无症状猪群中也有一定的检出率，存在隐性带毒现象，对养猪业生产存在潜在威胁。因此全面了解该病毒的生物学特性，探

6、究该病毒在引起仔猪尤其是断奶仔猪腹泻中所起的作用，对于降低经济损失、保障人类健康，具有重要的意义。本研究利用原核表达系统获得了猪札幌病毒CH430株VPg、3C、3D、p70和VP25种重组蛋白及其多克隆抗体，并利用酵母双杂交系统初步筛选出23种与VP2相互作用的已知蛋白。本研究首先采用一步法RT-PCR方法分别扩增猪札幌病毒CH430株VPg、3C、3D、p70、VP2目的片段，然后将这些目的片段分别亚克隆到pET-30a载体中，分别构建原核表达载体pET30a-VPg/3C/3D/p70/VP2，将其分别转化

7、到表达菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳确定得到的重组蛋白大小分别为22、23、67、81、26kDa，五种蛋白均主要以包涵体形式存在。采用NiSepharose6FastFlow纯化体系Ni-NTA亲和层析纯化方法进行纯化，获得浓度和纯度较高的VPg、3C、3D、p70、VP2重组蛋白，Western-blot鉴定表明VPg、3C、3D、p70、VP2重组蛋白均具有良好的抗原性；利用纯化的蛋白免疫家兔制备高免血清，能够得到高滴度的多克隆抗体，Western-blot检测表明，五种多

8、克隆抗体均能特异性识别相应的重组蛋白，为进一步研究上述蛋白的功能奠定了基础。本研究进一步以猪小肠粘膜上皮组织为模型，构建其酵母双杂交cDNA文库转化入感受态Y187酵母细胞中。以猪札幌病毒VP2基因构建酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7-VP2，并用醋酸锂法将其转化入Y2HGold酵母感受态细胞中，进行毒性检测和自激活检测；并将含有pGBKT7-VP2的Y2HGold酵母菌与