《泰山山区放牧沂蒙黑山羊寄生蜱虫的流行病学调查》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
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关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体。。，巧在文中明确说明本声明的法律责任由本人承担本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部口或机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被査飼和借阅。本人授权山东农业大学可Ｗ将本学位论文的全部＾１采用影印或部分内容编入有关数据库进行检索，可１＾、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并向社会公众提供信息服务。保密论文在解密后应遵守此规定。／论文作者签名：弄Ｋ蜂导师签名：．日期．６Ｘ：前 符号说明缩写英文全名中文全名DNAdeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸dNTPdeoxyribonuleosidetriphosphate脱氧核糖核苷三磷酸PBSphosphatebufferedsaline磷酸缓冲液PCRpolymerasechainreaction聚合酶链反应ODopticaldensity光密度值SDSsodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠KAcAceticacidpotassiumsalt醋酸钾Ampampicillin氨苄霉素pHpotentialofhydrogen酸碱度rpmrevolutionsperminute转速/分钟bpbasepair碱基对momola摩尔 目录中文摘要.....................................................................................................................................IAbstract...................................................................................................................................III1前言.........................................................................................................................................11.1蜱类生活史...........................................................................................................................11.2蜱类与疾病的关系...............................................................................................................21.2.1蜱传原虫病........................................................................................................................21.2.2蜱传立克次体....................................................................................................................31.2.3莱姆病................................................................................................................................51.2.4蜱传病毒............................................................................................................................61.2.5蜱瘫....................................................................................................................................71.3防制原则...............................................................................................................................71.3.1蜱虫的防制原则................................................................................................................81.3.2蜱传疾病的防控................................................................................................................81.4本研究的目的和意义..........................................................................................................82材料与方法..........................................................................................................................102.1材料....................................................................................................................................102.1.1研究地点与对象..............................................................................................................102.1.2引物、载体、酶和试剂.................................................................................................102.1.3主要仪器及设备.............................................................................................................102.1.4主要试剂配制.................................................................................................................102.2方法.....................................................................................................................................122.2.1蜱虫种类的调查..............................................................................................................122.2.2羊群蜱虫感染率..............................................................................................................222.2.3蜱虫寄生季节动态..........................................................................................................232.2.4蜱虫携带病原的调查......................................................................................................233结果与分析..........................................................................................................................253.1蜱虫种类.............................................................................................................................253.1.1形态学鉴定结果..............................................................................................................25 3.1.2分子鉴定结果..................................................................................................................263.2羊群蜱虫感染率.................................................................................................................283.3.蜱虫寄生期季节动态.........................................................................................................283.4沂蒙黑山羊不同部位蜱虫寄生比例.................................................................................303.5气候数据.............................................................................................................................353.6蜱虫数量与外界环境的相关分析.....................................................................................363.7蜱虫携带病原的调查.........................................................................................................364讨论........................................................................................................................................395结论.......................................................................................................................................45参考文献..................................................................................................................................46致谢...........................................................................................................................................54发表论文..................................................................................................................................55VIII 山东农业大学全日制硕士专业学位论文中文摘要蜱是专性吸血节肢动物，是许多动物的临时专性体表寄生虫，分布遍及全球，包括硬蜱科、软蜱科及纳蜱科三科，其中以硬蜱种类最多。蜱不仅刺吸宿主，吸食血液，对人畜造成很大危害；而且可传播多种人、畜疾病及人畜共患病，给人类健康和畜牧业发展带来极大危害。各类病原体不但能在蜱虫体内发育，还能在其体内长期存活并保持其感染力。在疾病的传播过程中，蜱的生态学和生物学特性共同决定了蜱与蜱传疾病的流行特点，同时也为制定蜱类综合防治对策和蜱传疾病的预防提供了科学依据，因此对其生物学特性进行研究具有非常重要的兽医学及流行病学意义。本研究以寄生于放牧沂蒙黑山羊体表的蜱虫为研究对象，在山东省泰山山区对寄生蜱虫的种类、阶段的季节动态、宿主体表分布、携带病原等生态学规律进行系统研究。研究结果对于阐明寄生蜱虫的生态学规律，研究蜱媒流行病学及蜱虫防制具有重要的理论意义和实际应用价值，并为后续开展更深入的研究打下基础。主要结果如下：1.蜱虫的鉴定经形态学及分子学鉴定，确定寄生蜱虫均为长角血蜱(Haemaphysalislongicornis)。2.蜱虫季节动态的调查研究中采用触诊和视诊检查法，调查羊群蜱虫感染率。结果显示，在3月份蜱虫开始在宿主体表出现时的感染率为40%，4至9月份宿主体表蜱虫感染率均为100%，10月份宿主蜱虫感染率为60%，之后逐渐消失。采用宿主体表调查法，对寄生阶段长角血蜱的季节动态进行调查。以调查数据为准，对寄生阶段长角血蜱的季节动态进行统计分析。结果显示，长角血蜱在每年3月中旬开始活动，寄生于宿主体表，10月中旬蜱虫开始在宿主体表大幅减少，11月中旬消失，3个虫态的世代发生重叠现象。其中幼蜱在8月上旬开始活动，9月中旬达到高峰，11月中旬消失；若蜱在3月上旬开始活动，5月中旬达到高峰，7月份从宿主体表消失，8月中旬重新出现，11月中旬再次消失；雌蜱在3月上旬至8月下旬都有活动，其季节高峰在7月，9月份雌虫从宿主体表消失；雄蜱在3月上旬至11月上旬都有活动，11月中旬从宿主体表消失。成蜱雌雄性比为2.9:1。3.蜱虫的分布及寄生密度研究中将羊体表分为耳部、头部、背部、腹股沟部、尾臀部和四肢部六个区域，对I 泰山地区放牧沂蒙黑山羊寄生蜱虫的流行病学调查蜱虫各发育阶段在宿主体表的寄生部位及不同部位寄生比例的调查结果显示，蜱虫的寄生部位主要有耳部、头部、腹部等，耳部所占比例最大，且寄生数量最大，可达1400只，头部次之，为600只。4.蜱虫的鉴定及携带病原的调查对长角血蜱携带病原的情况进行调查，未检测到贝氏柯克斯体、粒细胞无形体、查菲埃立克体和伯氏疏螺旋体，但长角血蜱感染吕氏泰勒虫，且各月份感染率不同，具有一定季节性。关键词：长角血蜱；吕氏泰勒虫；蜱媒疾病；流行病学II 山东农业大学全日制硕士专业学位论文TheEpidemiologicalInvestigationofParasiticTicksongrazingYimengBlackGoatsinTaishanMountainousAreaAbstractTicksareobligatebloodsuckingarthropod,parasiteinthebodysurfaceofmanyanimals,distributedoftheglobal,includingIxododae,ArasidaeandNuttalliellidae,withthelargestnumberofhardticks.Theyarenotonlystingthehostsandsuckingblood,causinggreatharmtohumanandlivestock;butalsotransmittingagreatvarietyofhuman,animaldiseasesandanthropozoonosis,providingseriousdamagetohumanhealthyandlivestockhusbandrydevelopment.Moreallkindsofpathogensnotonlydevelopinticksbutalsopreserveinfestingforalongtime.Intheprocessofthespreadofthediseases,theepidemiccharacteristicsofticksandtick-bornediseasesweredeterminedbytheecologyandbiologyofticks,atthesametime,alsooffersthescientificbasisfortheintegratedcountermeasuresofcontrollingticksandthepreventionoftick-bornediseases,sodoresearchofthebiologicalcharacteristicsofthetickhasveryimportanttheriatricsandepidemiologicalsignificance.ThisstudywascarriedoutinTaishanMountainousAreaofShandongprovince,andaseriesofstudiesbiologyofthetickwereconductedonthespecies，theseasonaldynamicofparasiticstages,distributiononthehostsandthecarriesofpathogensunderthetickwhichparasiteinthebodyofthegrazingYimengblackgoats.Inthisstudyinvestigationofhosts,statisticsetc.,andcross-disciplinaryapproachwereused.Theresultsresearchingthetick-bornediseasesinepidemiologicalstudiesandthecontrollingoftickshaveveryimportantvaluesoftheoryandpracticalapplication,laythefoundationformorein-depthsubsequentconductsimultaneously.Themainmethodsandfindingsareasfollows:1.IdentificationofticksDeterminedthetickisHaemaphysalislongicornisbyhistomorphologyandmolecularidentification.2.TheseasonaldynamicofthetickDependingonthepalpationandvisualexaminationinvestigatedtheinfectionofticksongoats.TheresultsshowedthatthetickbegintoappearinthehostsurfaceinMarch,andtheIII 泰山地区放牧沂蒙黑山羊寄生蜱虫的流行病学调查infectionis40%,andthenrapidlyriseto100%inApril,whileitfallto60%inOctober,finallydisappearedinthegoat.Usingthemethodofinvestigationhostsresearchthedynamicsoftheparasiticphaseofthetick.Theresultsshowedthatthetickbegintoappearinthehostinmid-March,anddisappearedinmid-November,andtherewasanoverlapamongthreestages.LarvaeappearedinearlyinAugustongoats,thenumberpeakinmid-October,thendisappearedinmid-November.WhilenymphappearedinearlyinAugustongoats,disappearedinJuly,afterthenappearedinmid-Augustagain,anddisappearedinmid-November,thenumberpeaksinmid-MayandAugustrespectively.Thefemaleactedinearly-Marchandlater-August,thenumberpeaksinJuly,disappearedinSeptember.Themaleactedinearly-Marchandearly-November,disappearedinmid-November.Intheentireperiodofthesurvey,thesexratiooffemalesandmaleswas2.9:1.3.DistributionandparasiticdensityofticksTheresultsininvestigationofparasiticpartsandtheproportionofthenumberondifferentpartsofthedifferentdevelopmentstagesofthetickshowedthatthemainsitesofparasiticwasear,head,abdomenandsoon,earhasthelargestproportioncanreached1400,onheadfollowedcanreached600.4.InvestigationthepathogensofticksTheresultsshowedthattherewerenoCoxiellaburneti、Anaplasmaphagocytophilum、EhrlichiachaffeensisandBorreliaburgdoferidetectedout,whiletheHaemaphysalislongicornisinfectedbyTheilerialuwenshun,andtheinfectionratesaredifferentineachmonthswithseasonal.Keywords：Haemaphysalislongicornis;Tick-bornediseases;Theilerialuwenshun;epidemiologyIV 山东农业大学全日制硕士专业学位论文1前言蜱属于节肢动物门（Arthropoda），蛛形纲（Arachida），蜱螨亚纲（Acari），寄螨总目（Parasitiformes），蜱亚目（Ixodida），蜱总科（Ixodoidea），包括硬蜱科（Ixododae），软蜱科（Arasidae）及纳蜱科（Nuttalliellidae），其中最常见、危害最大的是硬蜱科，其次是软蜱科，而纳蜱科仅在非洲南部发现一种（Drummond,1990）。蜱类是一类专营吸血的体表病媒生物(孔繁瑶，2010)。目前种类最多的世界蜱类名录是Anonym（2006）的《BrowseTaxonomicTree》，共计3科17属871种。我国蜱类有效属和有效种为2科10属119种（杨晓军等，2007；陈泽等，2008)。蜱虫是许多动物重要的体外寄生虫，不仅造成血液损失，而且可引起宿主皮肤的过敏反应，在刺伤处往往形成溃疡在其生命活动各个阶段都需要刺叮宿主，吸食宿主血液，不仅造成血液损失，而且可引起宿主皮肤的过敏反应，在刺伤处往往形成溃疡（陆宝麟，吴厚永，2007），有时还可引起宿主呈现运动功能麻痹性瘫痪，更为重要的是，它是许多病原体的传播媒介和保虫宿主，已知蜱可携带83种病毒、14种细菌、17种螺旋体、32种原虫以及衣原体，其中大多数是重要的自然疫源性疾病和人兽共患病，给人类健康及畜牧业发展带来很大危害。同时由于许多病原可在蜱虫体内存活数年，甚至可经卵垂直传播给下一代（孟阳春等，2004），扩大了疾病的传播，给人类健康以及畜牧业发展造成很大危害。因此研究蜱虫具有很重要的医学及经济学价值。1.1蜱类生活史蜱虫的发育需要经过卵、幼虫、若虫和成虫四个时期，幼虫、若虫及成虫这3个活跃期都要在宿主身上吸血。在幼虫变为若虫以及若虫变为成虫的过程中，都需要经过蜕皮。大多数硬蜱在动物体上进行交配，交配后吸饱血的雌蜱从宿主上脱落到地上，爬到缝隙内或土块下静伏不动，一般经过4-9天待血液消化及卵发育，此阶段称为产卵前期或孕卵期，之后，开始产卵。蜱虫的繁殖能力很强，一般硬蜱一生产卵数千个，革蜱属的森林革蜱产卵量可到6千只（LiuJetal.,2005），而璃眼蜱属的亚东璃眼蜱产卵量可达2个只以上（ChenZetal.,2008）；软蜱一生产卵多次，一般情况下，一生可产卵1千余只。卵产出后，经一段时期孵化为幼虫，该阶段称为卵期或孵化期。幼虫孵出后经过几天的休止期，才开始寻找宿主开始吸血，饱血后落地，蜕化为若虫再次侵袭宿主动物，经过几天的饱血后落地，蛰伏数天至数十天蜕皮为成虫，即为一个生活周期，或称为一个世代。硬蜱在发育过程中只有一个若虫阶段，软蜱有多个若虫阶段（Sonenshine,1 泰山地区放牧沂蒙黑山羊寄生蜱虫的流行病学调查1991）。蜱类完成其生活史所需时间的长短，随蜱的种类和环境条件而异。我国家畜体常见的微小牛蜱（Boophilusmicroplus）整个生活周期仅需50天，每年可发生4-5代，全沟硬蜱（Ixodexpersulcatus）一般3年完成一世代，有时延长至4年到5年，青海血蜱（Haemaphysalisqinghaiensis）一年一次变态，3年完成一世代，残缘璃眼蜱（Hyalommadetritum）、亚东璃眼蜱（HyalommaasiaticumKozlovi）、草原革蜱（Dermacentornuttalli）、森林革蜱（Dermacentorsilvarum）以及长角血蜱（Haemaphysalislongicornis）一年发生一世代，自然界中长角血蜱有孤雌生殖和两性生殖两个种群，周金林等（2004）在我国发现长角血蜱孤雌生殖种群，此外在四川（杨彩明等，2007）以及甘肃（李知新等，2007）也有发现长角血蜱孤雌生殖种群。1.2蜱类与疾病的关系蜱虫是许多脊椎动物的专性体外寄生虫，在其生命活动的各个阶段都需要吸食宿主动物的血液。由于蜱类的刺叮及吸血，造成宿主血液大量损失及皮肤过敏，动物由于过度失血或对其他疾病的敏感性提高而贫血、消瘦，甚至大量死亡。除此之外，蜱类还传播多种人、畜和野生动物疾病，对人类健康的危害仅次于蚊类，但在虫媒疾病中，由蜱传播的病原体种类最多，蜱可携带和传播多种病毒、细菌、立克次体、螺旋体、原虫和衣原体。此外，雌蜱唾液腺所还可分泌神经毒素，当蜱叮咬时，将唾液中的毒素注入人或动物体内。毒素主要侵犯宿主运动神经，造成运动纤维的传导障碍，引起人或动物肌肉麻痹或瘫痪。在蜱更换宿主时，可以同时传播疾病。此外，各类疾病的病原体还能在蜱体内发育，而且在多数情况下，可以经卵传播一代或多代，有的蜱虫还能在体内长期保存病原体并保持其感染力。蜱不仅是疾病的传播媒介，而且还起到贮存宿主的作用。1.2.1蜱传原虫病梨形虫病（Piroplasmosis）旧称焦虫病或血孢子虫病（Brown,1997），是一类经硬蜱传播，由顶复门（Apicomplexa），孢子虫纲（Sporozoea），梨形虫亚纲（Piroplasmida）中的巴贝斯科（Babesiida）巴贝斯属（Babesia）和泰勒科（Theileriidae）泰勒属(Theileria)原虫所引起的血液病的总称，包括巴贝斯虫病和泰勒虫病（孔繁瑶，2010）。梨形虫病主要经由蜱虫传播,一般呈急性经过。巴贝斯虫病为动物源性人畜共患病，巴贝斯虫主要寄生在红细胞内，分裂繁殖并产生毒素（陈启军，李德昌，1995），感染动物以高热、贫血、黄疸、血红蛋白尿和急性死亡为主要特征；而泰勒虫病以高热、黄疸、体表淋巴结肿大为典型特征。本病在世界各地流行,我国大部分省份均有分布,给2 山东农业大学全日制硕士专业学位论文我国畜牧业造成巨大损失（罗建勋等，2006）。迄今为止,全世界已记载的各种哺乳动物的巴贝斯虫有67种，泰勒虫有13种（蒋金书，2000）。大多数巴贝斯科原虫在硬蜱中的传播方式为经卵传播，泰勒科原虫在硬蜱中经期间传播。1.2.2蜱传立克次体立克次体(Rickettsias)是原核细胞型、微小短杆或球杆状多形态、革兰染色阴性的专性细胞内繁殖的微生物。在立克次体目(Rickettsiales)中包括立克次体(Rickettsiaceae)、巴通体(Bartonellaceae)和无形体(Anaplasmataceae)三科。其中立克次体分为立克次体属(Rickettsia)、恙虫病东方体属(Orientiat-sutsugamushi)、埃立克体属(Ehrlichiea)。迄今对人类有致病性的立克次体约有20余种，其引起的立克次体病在世界范围内呈散发性和季节性流行（范明远，2005）。其中通过蜱传播的立克次体称为蜱传立克次体，蜱传立克次体病(Tick-bornrickettsialdiseases，TBRD)是世界范围内严重威胁人和动物健康的自然疫源性疾病（郭雨微等，2012）。其中通过媒介蜱传播的人兽共患立克次体病有斑点热、Q热、埃立克体病中的人单核细胞埃立克次和人粒细胞埃立克体病等（Klompenetal.,2006）。1.2.2.1斑点热斑点热（Spottedfever）是由斑点热群立克次体（Spottedfevergrouprickettsiae，SFGR）中病原性立克次体引起的一组以急性发热和皮疹为主要症状的疾病的总称，包括落基山斑点热、北亚热、纽扣热、立克次体痘和昆士兰热等（牛东升，陈香蕊，2008）。斑点热主要传播媒介为蜱、螨，已证实发现的斑点热病中有20种对人具有致病性（俞树荣，陈香蕊，1999）。自中国从事斑点热研究以来，已经分离的斑点热群立克次体有西伯利亚立克次体、黑龙江立克次体、内蒙古立克次体和虎林立克次体，并证明目前在中国的吉林、黑龙江、内蒙古等13个省区存在斑点热群立克次体的自然疫源地。1.2.2.2Q热1937年，Derrick在澳大利亚的昆士兰（Queensland）发现了一种原因不明的发热性疾病，将其命名为Q热（Qfever），后来证明病原体为贝氏柯克斯体(Coxiellabumetii，俗称Q热立克次体)(Samueletal.,1985)。Q热的流行常与易感染家畜有直接关系。Q热的病程可分为急性期和慢性期，在急性期，抗II相抗原的抗体形成，高浓度的I相抗体通常表示病程进入了慢性期，急性Q热表现为发热、头痛、肌肉酸痛，常伴有肺炎、肝炎等；慢性Q热表现为心内膜炎、肉芽肿性肝炎、骨髓炎等。其病原贝纳柯克斯体为球杆状，无鞭毛、无荚膜的细胞内寄生菌（刘怡芳，张颖，2008）。贝纳柯克斯体是立克3 泰山地区放牧沂蒙黑山羊寄生蜱虫的流行病学调查次体族中目前已知唯一含有质粒的病原菌，现已发现4种质粒型(QpHI、QpRS、QpDV和QpDG)和无质粒型(plasmid-less)。QpHI为36kb，QpRS为39kb，QpDV为33.5kb，QpDG为51kb（陆德源，2002）。同时，贝纳柯克斯体也是所有立克次体中一可以不通过节肢动物而通过气溶胶方式就可使人及动物发生感染的病原体（俞树荣，2000）。目前Q热已成为世界上分布最广的人兽共患病之一（徐丽丽等，2012）。目前，经血清学流行病学调查和病例证实在北京、河北、内蒙古、黑龙江、吉林、辽宁、四川、重庆、云南、山东、安徽等二十多个省市自治区均存在Q热感染，且一年四季均有发病者（俞树荣，2000）。1.2.2.3埃立克体病无形体与埃立克体均属立克次体目，无形体科(Anaplasmatanceae)，变形菌纲，α亚群（张丽娟等，2007）。埃立克体(Ehrlichia)主要寄生在单核细胞、巨噬细胞、粒细胞等吞噬细胞或血小板内，引起人和动物埃立克体病(Ehlichiosis)，其病原体是革兰阴性、严格的细胞内寄生菌，属立克次体科(Rickettsiaceae)埃立克体族(Ehrlichiae)（温博海等，2003；Rikihisa,1991）。近年来，新发现3种可引起人类疾病的埃立克体：一是1987年报道，1991年分离鉴定的查菲埃立克体(E.chaffeensis)，主要侵犯人单核细胞，可引起人单核细胞埃立克体病(Humanmonocyticehrlichiosis,HME)，临床表现为发热、头疼、恶心、呕吐等，严重者导致肾功能衰竭和中枢神经系统受损，出现中毒性休克综合征，甚至死亡（Maedaetal.,1987;Andersonetal.,1991;Fichtenbaumetal.,1993）。二是1994年发现的嗜人粒细胞埃立克体(Humangranulocyticehrlichia),能够引起人粒细胞埃立克体病(Humangranulocyticehrlichiosis,HGE)（Walker,Dumler,1996）；三是于1935年发现，1968年确认的尤氏埃立克体(E.ewingii)，可引起犬粒细胞埃立克体病，Buller等（1999）的研究证实其亦可感染人。以上3种人埃立克体感染的临床表现基本相同，主要症状有头痛、发热、寒战、肌痛等，类似感冒症状,严重的可造成肾功能的衰竭和中枢神经系统的受损，甚至死亡。常见的化验异常有血小板、白细胞减少和转氨酶升高（曹务春等，2000）。查菲埃立克体引起的人单核细胞埃立克体病在美国广泛分布，在欧洲和非洲也有病例报道（曹务春，1997）。在中国福建、山东等省市也存在人单核细胞埃立克体感染的自然疫源地（丁淑军，2011）。1.2.2.4无形体病无形体病(Anaplasmosis)是一类新发的重要人兽共患自然疫源性疾病（Dumler,2005）。人粒细胞无形体病（Humangranulocyticanaplasmosis,HGA）是由粒细胞无形4 山东农业大学全日制硕士专业学位论文体（Anaplasmaphagocytophilum）侵染人末梢血中性粒细胞引起，以发热伴白细胞、血小板减少和多脏器功能损害为主要临床表现的新发人兽共患性疾病，其病原体无形体(Anapasma)为革兰阴性细胞专性寄生菌（宋锋林等，2011）。1994年，通过广泛的分子生物学方法对13例类似病例进行研究，结果发现该病原体明显不同于查菲埃立克体，故被命名为HGE（Bakkenetal.,1994;Chenetal.,1994）。此后，通过深入的研究发现，HGE与查菲埃立克体遗传亲缘关系较远，因此重新将其划分为无形体属，并更名为HGA。人粒细胞无形体病呈世界分布，不仅严重威胁人类健康，而且严重影响畜牧业经济的发展。据报道，欧美流行地区人群血清流行率为15%-36%（Bakkenetal.,1998;IJdoetal.,2000）。人粒细胞无形体病主要通过蜱虫的叮咬传播，为虫媒传染病。近年来分子生物学及血清学证据都证实亚洲许多国家包括日本（Ohashietal.,2005）、韩国（Parketal.,2003）以及我国存在该病。2006年10月，我国安徽省芜湖市弋玑山医院首次暴发人粒细胞无形体院内传播感染事件（ZhangLJetal.,2008）。我国近年的调查资料显示，已从新疆、内蒙、黑龙江、河北、湖北、浙江、山东、河南等地采集的蜱类中检测到粒细胞无形体；此外多种、属硬蜱可携带该病原体，如森林革蜱、嗜群血蜱、草原革蜱以及长角血蜱。1.2.3莱姆病莱姆病(Lymedisease)是新近认识的一种多系统感染的蜱传自然疫源性人兽共患病，因首先发现于美国康涅狄格州的莱姆(Lyme)镇而得名。1975年10月，在美国康涅狄格州发现罕见的“少年类风湿性关节炎”，之后，Steere（1977）等人经过回顾性调查，将其命名为“莱姆关节炎”。至1983年Burgdorfer等人证实达敏硬蜱螺旋体就是莱姆病的病原体（Steere,1989）。Johnson（1984）等人对达敏硬蟀螺旋体进行分子生物学研究之后，根据其DNA特性确定它为疏螺旋体属的一个新种，正式命名为伯氏螺旋体(Borreliaburgdorferi)。莱姆病(Lymedisease)是一种多系统感染的蜱传自然疫源性人兽共患病，其病原体为伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdoferi)。感染伯氏疏螺旋体后可引起多系统、多器官损害，如游走性红斑(erythemamigraras,EM)、神经炎、心肌炎、关节炎等，严重者可致残，甚至死亡（常华等，2006）。目前，世界上已有70多个国家报告发现该病，且发病率呈上升趋势，新的疫源地不断被发现。我国自1986年首次在黑龙江省海林地区发现莱姆病,全国陆续已有29个省(直辖市、自治区)报道该病。山东省于1992年首次报道5 泰山地区放牧沂蒙黑山羊寄生蜱虫的流行病学调查莱姆病,并于1997年分离到莱姆病螺旋体（王丽娟等，2007）。伯氏疏螺旋体属于原核生物界、螺旋体目、螺旋体科、疏螺旋体属的一种，是一个单细胞疏松盘绕的革兰阴性左旋螺旋体。根据DNA-DNA杂交和5S-23SrRNA基因间隔区MseI限制性酶谱，Borreliaburgdoferi伯氏疏螺旋体可以分为10个基因型或基因群：①狭义伯氏疏螺旋体（B.burgdorferisensustricto），②伽氏疏螺旋体（B.garinii），③阿弗西尼疏螺旋体（B.afzelii），④日本疏螺旋体（B.japonica），⑤法雷斯疏螺旋体（B.valaisiana），⑥安德森疏螺旋体（B.andersonii），⑦卢西塔尼亚疏螺旋体（B.lusitaiae），⑧坦尼基疏螺旋体（B.tanukii），⑨吐得疏螺旋体（B.turdae），⑩比塞蒂疏螺旋体（B.bissettiisp.nov）。研究表明，伯氏疏螺旋体在地理上并不是均匀分布的，北美菌株的基因种主要是B.buredorferisensustricto；欧洲菌株的基因种主要为B.garinii和B.afzelii；中国菌株的基因种与北美菌株明显不同，与欧洲菌株比较相似，大部分属于B.garinii，占58%，其次为B.buredorferisensustricto和B.afzelii，分别占22%和20%，北方以B.garinii和B.afzelii为主，南方以B.buredorferisensustricto为主（廖德丰等，2004）。在上述10个基因型中，能够从莱姆病病人组织中分离到的基因型称为致病性基因型，公认的为B.burgdorferisensustricto、B.afzelii和B.garinii三种，一般认为，B.burgdorferisensustricto与关节炎，B.garinii与神经螺旋体病，B.afzelii与慢性萎缩性肢皮炎（acrodermatitischronicaatrophicans,ACA）密切相关。莱姆病的流行呈现分布范围广，但疫区相对集中的特点，呈地方性流行。硬蜱能大量生长繁衍的山区、林区、牧区此病多发；其次,具有明显的季节性，多发生于温暖季节，一般从5月开始，11月终止（金鑫，苏敬良，2005）。我国已从全沟硬蜱、粒形硬蜱(I.granulatus)、嗜群血蜱(H.concinna)、长角血蜱(H.longicornis)、二棘血蜱(H.bispinosis)、草原革蜱(D.nuttalli)和森林革蜱(D.silvarum)等多种蜱中分离出伯氏疏螺旋体。蜱叮咬动物时，伯氏疏螺旋体随蜱唾液进入皮肤，也可能随蜱粪便污染动物的创口而进入体内。另外，有研究表明，莱姆病在人、牛、马、鼠等动物中可通过胎盘垂直传播；动物与动物间可通过尿液相互感染，甚至可以传染给接触密切的人；皮下注射及输血也可能引起本病的传播。1.2.4蜱传病毒1.2.4.1森林脑炎病毒森林脑炎(Forest-springencephalitis）又称蜱传脑炎(Tick-borneencephalitis,TBE)，是由森林脑炎病毒引起，经蜱传播，以中枢神经病变为特征的急性传染病（张思华，6 山东农业大学全日制硕士专业学位论文2012）。传染源是带病毒的多种蜱类及宿主动物(如带病毒的哺乳类及鸟类)，人类多由蜱叮咬后经皮肤、粘膜感染。我国于1942年发现该病，1952年从患者及蜱中分离到森林脑炎病毒（自登云等，1995）。该病多发于6-7月间，潜伏期2-3周，接触林木作业的人群发病率较高。森林脑炎病毒至少有3个亚型，即西欧亚型、远东亚型和西伯利亚亚型。其中欧洲亚型主要经蓖籽硬蜱传播；远东亚型、西伯利亚亚型两者主要经全沟硬蜱传播（Pedro,Boris,2003）。该病在我国主要分布于东北的长白山和小兴安岭地区，云南及新疆的林区。1.2.4.2克里米亚-刚果出血热病毒克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congohemorrhagicfever,CCHF)又称新疆出血热(Xinjianghemorrhagicfever,XHF），我国于1965年首次在新疆南部发现该病流行。可经变态发育和经卵传递，经过叮咬而感染宿主。疫区的野生动物及放牧的家畜是本病主要传染源，多种蜱，尤其是璃眼蜱属是该病的重要传播媒介(Linthicum,Bailey,1994),在中国该病主要分布于新疆地区，此外，在青海、内蒙、四川、安徽、海南等地区的人和动物中均有发现。1.2.4.3发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒2010年6月，河南、山东等省发生蜱咬人致死事件，根据病例发热，头痛、肌肉酸痛以及血小板减少等临床表现暂将其命名为发热伴血小板减少综合征（Severefeverwiththrombocytopeniasyndrome,SFTS），之后在患者血液中分离到一种新型布尼亚病毒，命名为SFTSV(YuXJatel.,2011)。随后，陈华忠（2011）等在浙江、刘芸（2012）等在辽宁省相继发现病例，从而明确了SFTSV在中国东部地区流行。该病毒在媒介昆虫中可持续感染，可经卵、经交配传播，而且已有人传人的报道(GaiZatel.,2012;LiuYatel.,2012)。1.2.5蜱瘫蜱虫的唾液腺能分泌毒素，可使家畜产生厌食、体重减轻和代谢障碍等轻微症状。但某些种的雌蜱(如长角血蜱等)的唾液腺可分泌一种神经毒素，该毒素可抑制肌神经接头处乙酰胆碱的释放活动，造成运动性纤维的传导障碍，引起动物肌肉麻痹或瘫痪，称为"蜱瘫痪"。1.3防制原则1.3.1蜱虫的防制原则7 泰山地区放牧沂蒙黑山羊寄生蜱虫的流行病学调查1.3.1.1个人防护加强个人防护，应尽量避免在蜱类主要栖息地如草地、树林等环境中长时间坐卧。如须要进入此类地区，应穿长袖衣裤，扎紧裤腿，袖口和领口，对裸露的皮肤可涂驱避剂。发现蜱后应立即清除；被蜱叮咬，以正确的方式移开蜱虫，即用酒精涂在蜱虫叮咬部位，使其头部放松或死亡，几分钟后用镊子将其慢慢取出，之后对蜱所待的部位进行彻底消毒，用肥皂洗手。1.3.1.2环境防制采取轮换放牧及更换圈舍，及时清理禽畜圈舍的卫生，保持圈舍干燥清洁，堵住圈舍裂缝防制蜱类滋生。1.3.1.3化学防制可在禽畜的圈舍喷洒药物，并对家畜进行定期药浴杀蜱。1.3.1.4生物防制利用蜱虫的天敌进行防制，如膜翅目跳小蜂科的寄生蜂，它们可在某些硬蜱、血蜱、璃眼蜱及扇头蜱的若虫内产卵，待发育为成虫致使蜱死亡；白僵菌、黄曲霉等多种真菌对蜱类也有寄生和致死作用。1.3.1.5免疫防制1995年研制出预防微小牛蜱的商业化疫苗TickGardTM（Willadsenatel.1995）和GavacTM（Rodriguezatel.,1995），能使免疫牛所感染蜱的数量下降89%。Jonsson（2000）等研制出的商业化重组疫苗TickGARDHplus，可使牛体上第一代蜱的数量可以降低56%。1.3.2蜱传疾病的防控对蜱传疾病的防控主要有以下手段，开展监测，调查媒介蜱虫的种类、分布范围、贮存宿主以及其生长特征；调查蜱传病原体的种类，以确定不同地区不同种类的蜱虫所携带病原体的种类。对蜱传疾病的致病机制如病原体特征、主要媒介、贮存宿主、毒力以及致病性等进行探究，研制有效药物或疫苗，从而更好的从病原体方面预防蜱传疾病的发生。1.4本研究的目的和意义我国蜱类种类繁多，据不完全统计，有6属20种蜱是疾病的传播媒介。蜱的宿主包括200多种哺乳动物、120种鸟类、少数爬行类和两栖类动物，它们是专性吸血的外寄生动物，给人类健康以及畜牧业带来极大危害。据报道，全世界每年由蜱类造成的经济损8 山东农业大学全日制硕士专业学位论文失高达70亿美元。泰山山区地理坐标东经117°10'-117°23'，北纬36°10'-36°29'，属暖温带大陆性半湿润季风气候，春夏秋冬四季分明，年平均降雨量850mm，全年平均气温11.8℃，最热月平均23.1℃，最冷月平均气温-3.5℃，全年日照平均2678小时，无霜期200天。区内植被条件较好，森林面积18万亩，森林覆盖率82.6%，在部分地段可达95%。沂蒙黑山羊是该区主要的经济动物，常有蜱虫寄生，严重受侵害的羊只寄生蜱虫少则几百只，多则上千只，由于被蜱叮咬，影响山羊采食和睡卧，并引起皮炎或溃疡，造成羊只贫血、消瘦、羔羊生长发育受阻等，对当地畜牧业生产产生极大危害。本研究以泰山山区内放牧的沂蒙黑山羊为调查对象，研究寄生期蜱虫各发育期的种群消长规律，记录世代发生的规律，观察各发育期在宿主体上不同部位的寄生比例，以及沂蒙黑山羊蜱虫感染率，蜱虫携带病原的情况，从而为做好蜱类的预防工作和蜱传疾病的防控工作提供重要的依据。9 泰山地区放牧沂蒙黑山羊寄生蜱虫的流行病学调查2材料与方法2.1材料2.1.1研究地点与对象本项目研究地点选择在山东省泰安下港乡，研究对象为该山区放牧的沂蒙黑山羊。2.1.2引物、载体、酶和试剂本研究中用到的所有引物均由上海生工公司合成。E.coliTOP10用于筛选重组质粒，由本实验室保存。TA载体（Trans1-T1）用于目的基因的克隆，由本实验室保存。限制性内切酶XbaI、NotI，均购自购自大连TaKaRa公司。PCR反应试剂（Taq、dNTP、10×PCRbuffer）、DNAMarker（2Kb）、DNA连接酶、质粒小提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒，均购自北京全式金公司。2.1.3主要仪器及设备电子天平（上海恒平科学仪器有限公司）；体视显微镜（OlympusSZH-ILLD）；荧光显微镜(TE-2000-S，尼康，日本)；PCR仪（Eppendorf，德国）；电泳仪（北京君意，中国）；凝胶成像仪（BIORAD，美国）；离心机（上海安亭科学仪器厂）；振荡器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；水平摇床（WD-9405B，北京六一有限公司）；电热恒温水浴锅（北京市长风仪器仪表公司）。2.1.4主要试剂配制2.1.4.1碱裂解法提取DNA相关试剂（1）Lysisbuffer(100mL)：2.5mL，1MTris-HCl(pH8.0)；2mL，0.5MEDTA(pH8.0)；5mL，20%葡萄糖；250mg，溶菌酶定容至100mL，分装-20℃保存。①1MTris-HCl(pH8.0)：称取121.1gTris，加入800mL水溶解，用HCl调pH至8.0，定容至1L，高压灭菌，室温保存。②：0.5MEDTA(pH8.0)：秤取186.1gNa2EDTA∙2H2O，加入800mL水溶解，用NaOH调pH至8.0（约20gNaOH），定容至1L，高压灭菌，室温保存。③20%葡萄糖：称取20g葡萄糖，溶解于80mL水中，4℃保存。10 山东农业大学全日制硕士专业学位论文（2）SDS-NaOH(10mL)：8.8mL，H2O；200μL，10MNaOH；1mL，10%SDS；混匀，现配现用。组分配方：①10MNaOH：称取40gNaOH溶于50mL水中，定容至100mL，室温保存。②10%SDS：称取10gSDS溶于90mL水中，室温保存。（3）PBS缓冲液（500mL，pH7.4）：4.25gNaCl，0.178gNaH2PO4·2H2O，1.386gNa2HPO4·12H2O，溶解定容至500mL，调节pH至7.4，室温保存。（4）3.2MKAc：称取31.42gKAc，加水溶解，调节pH至5.2，定容至100mL，室温保存。（5）苯酚-氯仿-异戊醇：Tris平衡酚、氯仿、异戊醇按照25：24：1的比例进行混合，4℃保存。Tris平衡酚，4℃保存；氯仿，常温保存；异戊醇，常温保存。均购自于杭州普天生物技术有限公司。2.1.4.2核酸电泳有关试剂配制（1）50×TAEBuffer（pH8.5）：称取242gTris，37.2gNa2EDTA·2H2O，置于1L的烧杯中，向烧杯加入800ml的去离子水，充分溶解后，加入57.1ml的乙酸，搅拌充分，再加去离子水定容至1000ml，室温下保存，在使用过程中，用去离子水稀释至1倍使用。（2）1.0%琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖，溶于100ml1×TAEBuffer中，于微波炉中加热溶胶，待溶液变清亮后，冷却，加入1μLEB后倒胶。（3）0.8%琼脂糖凝胶：称取0.8g琼脂糖，溶于100ml1×TAEBuffer中，于微波炉中加热溶胶，待溶液变清亮后，冷却，加入1μLEB后倒胶。2.1.4.3其他有关试剂配制（1）LB培养基（1L）：10g胰蛋白胨，5g酵母浸出物，10gNaCl，定容至1L，高压灭菌，4℃保存备用。（2）20mg/mL氨苄霉素：称量2gApm，用蒸馏水溶解、定容至100mL，0.22μm11 泰山地区放牧沂蒙黑山羊寄生蜱虫的流行病学调查滤器过滤除菌，分装于高压灭菌的1.5mL离心管中，每管1mL，-20℃保存备用。（3）Amp/LB固体培养基（100mL，50μg/mL）：1g胰蛋白胨，0.5g酵母浸出物，1gNaCl，1.5g琼脂，定容至100mL，高压灭菌，水浴调温至50℃-60℃，加入50mg/mLAmp100μL，旋转混匀，铺制平板，4℃保存备用。（4）0.1mol/L的CaCl2：取出1mol/L的CaCl2（11.1gCaCl2加入到100mL四蒸水中）灭菌贮存液10mL加90mL灭菌水稀释至100mL。1M的CaCl2贮存液事先0.22μm滤膜过滤除菌，后保存于4℃。2.2方法2.2.1蜱虫种类的调查随机在下港乡选择4家放牧沂蒙黑山羊养殖户，记录羊群羊只总数，在羊群中随机捉12只沂蒙黑山羊，采集50只蜱虫，每月采集200只蜱虫，带回实验室，对蜱虫进行形态学及分子学鉴定，确定蜱虫种类。此项工作在2014年3月至11月进行。2.2.1.1形态学观察将采集到的蜱虫，在70%酒精中浸泡后，将蜱虫取出用吸水纸吸干，在体视显微镜下观察其形态特征。按照（陆宝麟，吴厚永，2007）蜱类检索表，进行形态学鉴定：血蜱属分种检索表如下：雌蜱1须肢棒形，外缘与内缘近乎平行，第2节长，明显大于第3节…………………2须肢前窄后宽，外缘弧度大于内缘弧度，第2节略长于第3节…………………52(1)盾板长明显小于宽；口下板齿式3/3………………………………………………3盾板长等于或略大于宽；口下板齿式4/4～5/5……………………………………43(2)孔区长卵形，与假头基后缘几乎连接，假头基宽为长的3倍以上；须肢第2节腹面内缘刚毛2根；足基节2内距短，但超过该节后缘……………………………Haemaphysalisvitnamensis越南血蜱孔区宽短，明显离开假头基后缘，假头基宽不到长的3倍；须肢第2节腹面内缘刚毛1根；足基节2内距短，不超过该节后缘……………………………………Haemaphysaliskitaokai北岗血蜱4(2)假头基突明显，三角形；基节1、2内距较粗，末端钝；须肢第2节腹面内缘刚毛3根……………………………………………Haemaphysaliswarburtoni汶川血蜱12 山东农业大学全日制硕士专业学位论文假头基突不明显，粗短;基节1、2内距较窄长，末端较尖向外弯；须肢第2节腹面内缘刚毛5根…………………………………Haemaphysalisdanieli丹氏血蜱5(1)须肢第2节后外角强烈突出，显著超过假头侧缘，两侧须肢外缘相合呈锐楔形……………………………………………………………………………………6须肢第2节后外角轻、中度突出，略超过假头侧缘，两侧须肢外缘相合呈钝楔形或亚梯形……………………………………………………………………………146(5)口下板齿式7/7～8/8；须肢第2节背面后缘外侧有2个齿状角突，一长一短………………………………………………………Haemaphysalisasiatica亚洲血蜱口下板齿式3/3～5/5；须肢第2节背面后缘不具或靠外侧有1个三角形角突…77(6)须肢第3节腹刺发达，末端达第2节中部；须肢第2节背面后缘呈波状或角状………………………………………………………………………………………8须肢第3节腹刺短，末端至多略超过第2节前缘；须肢第2节背面后缘平直或浅弧形……………………………………………………………………………………98(7)口下板齿式4/4；须肢第3节宽大于长；气门板背突短钝………………………Haemaphysaliscornigera具角血蜱口下板齿式5/5；须肢第3节宽小于长；气门板背突不明显……………………Haemaphysalisornithophila嗜鸟血蜱9(7)盾板椭圆形，中部最宽；须肢第3节腹刺略拐向内侧…………………………10盾板心形，前部最宽；须肢第3节腹刺拐向后外方……………………………1210(9)须肢第2节后外角突出较小，外缘弧形凹入，其长度略大于第3节外缘，须肢第2节背面内缘刚毛2根；腹面内缘刚毛4～6根……………………………………Haemaphysalissinensis中华血蜱须肢第2节后外角突出显著，外缘凹入深，其长度明显大于第3节外缘………1111(10)口下板齿式4/4；基节4内距三角形，指向后方……………………………………Haemaphysalisdoenitzi钝刺血蜱口下板齿式5/5；基节4内距窄长，指向后内侧………………………………………Haemaphysalisphasiana雉鸡血蜱12(9)口下板齿式3/3;爪垫约达爪长的2/3，须肢第2节背面内缘刚毛2根；腹面内缘刚毛3～4根………………………………………Haemaphysalisverticalis草原血蜱口下板齿式4/4；爪垫不及爪长的1/2………………………………………………1313 泰山地区放牧沂蒙黑山羊寄生蜱虫的流行病学调查13(12)须肢第2节腹面后缘稍弯，呈浅弧形；须肢第3节背面前端尖；须肢第2节背面内缘刚毛2～3根；腹面内缘刚毛10根，排列紧密…………………………………Haemaphysaliserinaceituranica短垫血蜱须肢第2节腹面后缘中央强度后弯，呈深弧形；须肢第3节背面前端圆钝；须肢第2节背面内缘刚毛1～2根；腹面内缘刚毛3～4根……………………………Haemaphysaliscampanulata铃头血蜱14(5)须肢第3节背面后缘有三角形刺突………………………………………………15须肢第3节背面后缘无刺突………………………………………………………1815(14)盾板心形，前部1/3处最宽；孔区直立或略内斜，须肢第2节背面内缘刚毛2～3根；腹面内缘刚毛5根………………………………Haemaphysalisyeni越原血蜱盾板近似圆形，中部最宽；孔区明显内斜…………………………………………1616(15)口下板齿式4/4；颈沟末端略超过盾板中部，须肢第2节背面内缘刚毛3根；腹面内缘刚毛4根……………………………………Haemaphysalishystricis豪猪血蜱口下板齿式5/5；颈沟末端或长或短………………………………………………1717(16)颈沟末端约达盾板中部；基节2、3内距宽短，似三角形，基节4内距粗短；须肢第2节背面内缘刚毛2～4根；腹面内缘刚毛4～7根……………………………Haemaphysalismageshimaensis日岛血蜱颈沟末端伸达盾板后1/3；基节2～4内距形状近似；须肢第2节背面内缘刚毛3根；腹面内缘刚毛4～5根……………………Haemaphysalislongicornis长角血蜱18(14)盾板长大于宽，似盾形；孔区小；各转节腹距尖，大小约等；须肢第2节背面内缘刚毛3根；腹面内缘刚毛8根；口下板齿式为6/6～7/7…………………………Haemaphysalismontgomeryi猛突血蜱盾板长约等于宽，或宽大于长；孔区或大或小……………………………………1919(18)盾板宽大于长，约1.2倍；须肢第2节腹面后缘明显凸出，呈钝刺状…………20盾板宽约等于长；须肢第2节腹面后缘不呈钝刺状凸出…………………………2120(19)假头基基突粗大，齿状突出；盾板中部最宽；颈沟末端接近盾板后侧缘；气门板背突短钝，明显……………………………Haemaphysalisformosensis台湾血蜱假头基基突宽短，三角形，齿状突出；盾板前部最宽；颈沟短浅；气门板背突不明显……………………………………………Haemaphysalisaborensis阿波尔血蜱21(19)背面观须肢第2节后外缘圆钝，或外缘轮廓圆钝；爪垫约达爪长的1/2，须肢第14 山东农业大学全日制硕士专业学位论文2节背面内缘刚毛2根；腹面内缘刚毛4根………………………………………Haemaphysalisqinghaiensis青海血蜱背面观须肢第2节后外缘呈角状；爪垫达到或接近爪端…………………………2222(21)足基节2～4内距短钝，不超过或略超出该节后缘；颈沟达盾板后1/3…………23足基节2～4内距长尖，明显超出该节后缘；颈沟或长或短……………………2423(22)须肢第2节外缘与第3节外缘几乎等长；基节1内距明显长于基节2～4内距………………………………………………Haemaphysalisconcinna嗜群血蜱须肢第2节外缘明显短于第3节外缘；基节1内距略长于基节2～4内距………Haemaphysalisjaponica日本血蜱24(22)颈沟短，达盾板中部；气门板卵圆形，背腹轴大于前后轴………………………Haemaphysalisbirmaniae缅甸血蜱颈沟长，几乎达盾板后侧缘；气门板呈圆形，背腹轴约等于前后轴……………2525(24)须肢第2节外缘向内浅弯；口下板齿冠短，约占有齿部分长1/5…………………Haemaphysalisflava褐黄血蜱须肢第2节外缘直；口下板齿冠较长，约占有齿部分长1/4…………………………Haemaphysalismoschisuga嗜麝血蜱雄蜱1须肢短棒状，外缘与内缘的弧度约等或近乎平行，第2节不具后外角………2须肢前窄后宽，外缘弧度大于内缘弧度，第2节后外角突出…………………52(1)假头基无基突；盾板无侧沟………………………………………………………3假头基有明显基突；盾板具侧沟…………………………………………………43(2)背面观假头基侧缘前半段直，后半段向外凸出；须肢第2节腹面内缘刚毛1根；气门板段背腹缘不平行；盾板颈沟短、浅，向后略外斜…………………………Haemaphysaliskitaokai北岗血蜱背面观假头基全段向外弧形凸出；须肢第2节腹面内缘刚毛2根；气门板前段背腹缘平行；盾板颈沟短、深，向后略内斜……………………………………Haemaphysalisvitnamens越南血蜱4(2)盾板侧沟后端达第1缘垛；假头基突锥形，长度约等于基突基部宽度；须肢第2节腹面内缘刚毛3根……………………Haemaphysaliswarburtoni汶川血蜱盾板侧沟后端达第2缘垛；假头基突较短，长度小于基突基部宽度；须肢第215 泰山地区放牧沂蒙黑山羊寄生蜱虫的流行病学调查节腹面内缘刚毛4根…………………………Haemaphysalisdanieli丹氏血蜱5(1)背面观须肢第2节后外角强烈突出，显著超过假头基侧缘，两侧须肢外缘相合呈锐楔形…………………………………………………………………………6背面观须肢第2节后外角略突出，两侧须肢外缘相合呈钝楔形或亚梯形……146(5)口下板齿式6/6～7/7；须肢第2节背面后缘靠外具2个齿状角突，一长一短………………………………………………Haemaphysalisasiatica亚洲血蜱口下板齿式3/3～5/5；须肢第2节背面后缘靠外具1个齿状角突，或不具明显角突…………………………………………………………………………………77(6)足基节4具2个细长针状内距，长度明显超过该节长度的1/2，须肢第3节背面后外侧具粗大锐刺，显著超过第2节外缘………………………………………Haemaphysaliscornige具角血蜱足基节4内距较短，三角形或锥形，长度不超过该节长度的1/2………………88(7)口下板齿式3/3；盾板上刻点不明显，细小而稀疏；须肢第2节背面内缘刚毛2根；腹面内缘刚毛3根………………………Haemaphysalisverticalis草原血蜱口下板齿式4/4；盾板上刻点明显，多而密或分布不均匀………………………99(8)盾板侧沟短，后端达气门板后缘；跗节4粗短，亚端部急转收窄，斜度大………Haemaphysaliscampanulata铃头血蜱盾板侧沟长，后端延伸至第1或第2缘垛；跗节4亚端部逐渐收窄，斜度适中……………………………………………………………………………………1010(9)须肢第3节腹面刺突长，末端达第2节中部；盾板侧沟短，前端达基节3中部水平线………………………………………Haemaphysalisornithophila嗜鸟血蜱须肢第3节腹面刺突短，末端达或略超过第2节前缘；盾板侧沟长，前端明显超过基节3中部水平线……………………………………………………………1111(10)须肢第3节腹刺拐向后内侧；足基节4内距三角形，指向后内侧………………Haemaphysalisphasiana雉鸡血蜱须肢第3节腹刺拐向后方；足基节4内距亦指向后方…………………………1212(11)口下板齿式5/5；须肢第2节外缘短，不及第3节外缘长；须肢第2节背面内缘刚毛3根；腹面内缘刚毛5根………………Haemaphysalissinensis中华血蜱口下板齿式4/4；须肢第2节外缘长，明显超过第3节外缘长………………1313(12)基节1内距较窄，长度稍大于其基部宽度，爪垫不及爪长的1/2，须肢第2节背16 山东农业大学全日制硕士专业学位论文面内缘刚毛2～3根；腹面内缘刚毛10根，排列紧密……………………………Haemaphysaliserinaceituranica短垫血蜱基节1内距粗短，长度小于其基部宽度，爪垫明显超过爪长的1/2………………Haemaphysalisdoenitzi钝刺血蜱14(5)须肢第3节背刺发达………………………………………………………………15须肢第3节无背刺…………………………………………………………………1815(14)盾板无侧沟………………………………………………………………………16盾板有侧沟…………………………………………………………………………1716(15)口下板齿式4/4；假头基基突长略小于其基部宽度，末端钝；须肢第2节背面内缘刚毛2根；腹面内缘刚毛4根………………Haemaphysalishystricis豪猪血蜱口下板齿式5/5；假头基基突长等于或略大于其基部宽度，末端尖；须肢第2节背面内缘刚毛3根；腹面内缘刚毛4根………Haemaphysalisyeni越原血蜱17(15)盾板侧沟短，前端不超过盾板中部，后端达气门板后缘；足基节2～4内距较长，末端尖；须肢第2节背面内缘刚毛2根，腹面内缘刚毛7根…………………Haemaphysalismageshimaensi日岛血蜱盾板侧沟长，前端超过盾板中部，后端达第1缘垛；足基节2～4内距较短，末端钝；须肢第2节背面内缘刚毛2根，腹面内缘刚毛4根……………………Haemaphysalislongicornis长角血蜱18(14)口下板齿式4/4，盾板侧沟退化或很短，前端不达盾板中部；须肢第2节背面内缘刚毛2根，腹面内缘刚毛3根………………Haemaphysalisbirmaniae缅甸血蜱口下板齿式5/5，盾板侧沟较长，前端至少达盾板中部…………………………1919(18)盾板侧沟后端达气门板后缘………………………………………………………20盾板侧沟后端达第1缘垛…………………………………………………………2120(19)足基节4内距长，针状；跗节4腹缘在假关节远侧有1个明显角突；盾板颈沟短，自盾板中部达气门板后缘……………………Haemaphysalisflava褐黄血蜱足基节4内距短，三角形；跗节4腹缘无角突；盾板颈沟较长，自足基节3后缘水平线达气门板后缘……………………Haemaphysalismoschisuga嗜麝血蜱21(19)须肢第3节腹刺较长，末端超过第2节中部；须肢第2节后缘具1根细窄长刺，末端尖，几乎达第1节后缘；须肢第2节背面内缘刚毛2根，腹面内缘刚毛6根；口下板齿式6/6………………………Haemaphysalismontgomeryi猛突血蜱17 泰山地区放牧沂蒙黑山羊寄生蜱虫的流行病学调查须肢第3节腹刺较短，末端达到或略超过第2节前缘；须肢第2节后缘无刺或后缘形成粗大角突，末端钝………………………………………………………2222(21)跗节2～4亚端部背腹缘均略隆起，爪垫均达爪长1/2，须肢第2节背面内缘刚毛2根，腹面内缘刚毛4～6根…………Haemaphysalisqinghaiensis青海血蜱跗节2～4亚端部背腹缘均不隆起，爪垫均达爪长2/3…………………………2323(22)足基节2～4内距末端尖细，明显超出各节后缘；须肢第3节顶端圆钝、圆或平……………………………………………………………………………………24足基节2～4内距末端钝，略超出各节后缘；须肢第3节顶端尖气门板背突短钝……………………………………………………………………………………2524(23)假头基基突强大；须肢第2节腹面后缘向后延伸，形成粗大角突；口下板齿式5/5～6/6………………………………………Haemaphysalisformosensis台湾血蜱假头基基突粗短；须肢第2节腹面后缘较平，无角突；口下板齿式5/5……………Haemaphysalisaborensis阿波尔血蜱25(23)须肢第3节顶端向内侧弯曲，两侧须肢合拢时交叠成钳状；口下板齿式6/6；气门板背突不明显…………………………………Haemaphysalisconcinna嗜群血蜱须肢第3节顶端不向内侧弯曲；口下板齿式5/5；气门板背突短钝…………………Haemaphysalisjaponica日本血蜱2.2.1.2分子鉴定根据上述形态学鉴定结果，设计该种蜱类特异性引物，并进行PCR扩增。（1）PCR引物依据长角血蜱线粒体COI（线粒体细胞色素氧化酶亚基I）基因，设计PCR扩增特异性引物：上游引物COI-F（5'-3'：ATTTTTGGTGCTTGAGCCGGA）与下游引物COI-R（5'-3'：GTAAATATATGATGTGCCCAG）。（2）提取蜱虫基因组用70%的酒精清洗蜱虫3次，置于干净平皿上使酒精自然挥发。然后用碱裂解法提取蜱虫基因组：①将清洗干净的蜱虫置于研钵内，进行充分研磨。加入1.5mLLysisBuffer和100µL5µg/µL的蛋白酶K，移至5mL离心管中，60℃水浴10min；②加入2mL现用现配的SDS-NaOH（10mL：8.8ml无菌水，1mL10%SDS，0.2mL10MNaOH），反复颠倒数次使其混匀，静置5min；18 山东农业大学全日制硕士专业学位论文③加入1.5mL3.2KAc（pH5.2)，多次混匀，静置5min；④10000rpm离心15min；⑤取上清，加入到新的5mL离心管中，每管2mL，加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）混合液；⑥10000rpm离心15min，取上清，加入到新的2mL离心管中；⑦加入2.5倍体积的冰乙醇，于-20℃放置30min；⑧10000rpm离心15min。弃上清，开盖静置，挥发乙醇；⑨加入50µL65℃预热的洗脱液EB重悬，加入1.5µLRNA酶，标记，-20℃保存备用。（3）蜱虫COI基因的扩增以蜱虫DNA为模板，COI-F与COI-R为引物扩增COI基因片段。反应体系如表2-1所示。PCR反应程序：反应条件为94℃预变性5min，接着是94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸10min。之后取5µLPCR产物，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，紫外凝胶成像系统观察结果。（4）蜱虫COI基因片段PCR产物的回收PCR扩增产物经凝胶电泳检测，结果为阳性的，对目的片段进行胶回收。根据琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书进行，其步骤如下：①将PCR产物在0.8％的琼脂糖凝胶上进行电泳，90V电压至电泳结束；②在紫外灯下，用干净的刀片将要回收的DNA条带切下，尽量切除不含DNA的凝胶，将得到的凝胶置于1.5mL离心管中，加入3倍体积的溶胶液GSB；③在50℃水浴锅中使琼脂糖凝胶融化，冷却至室温；④将混合液（不超过700µL）转移至带有收集管的吸附柱内。12000rpm离心1min，弃滤液。放回吸附柱，重复这一步骤，至混合液转移完全；⑤加入650µL的WB溶液洗涤。12000rpm离心1min，弃掉滤出液，并重复一次；⑥12000rpm开盖离心2min，取出后，静置数分钟，以除去残留的乙醇；⑦转移吸附柱至1.5mL离心管中，加入40µL65℃预热的洗脱液EB至膜中央，55℃水浴锅放置5min，然后12000rpm离心2min。重复洗脱一次，室温静置数分钟，12000rpm离心5min，收集洗脱液。⑧将洗脱出的DNA做好标记，置于-20℃保存，备用。19 泰山地区放牧沂蒙黑山羊寄生蜱虫的流行病学调查表2-1PCR反应体系（25µL）Table2-1PCRMixtureforamplificationofDNAfragments（25µL）PCR体系25μL10×PCRBuffer2.5μLdNTPs2.0μLCOI-F1.0μLCOI-R1.0μL模板DNA1.0μLTaqDNA聚合酶0.2μLddH2O17.3μL（5）PCR胶回收产物与TA载体的连接将胶回收产物与TA载体（Trans1-T1）在22℃条件下连接4h，连接体系如表2-2所示。（6）Top10大肠杆菌感受态细胞的制备①挑取Top10大肠杆菌单菌落于3mL无抗液体LB培养基中，37℃220rpm培养10h；②取1mL菌液接种于50mL无抗液体LB培养基中，37℃220rpm培养约3h，至OD600在0.6-0.8之间；③在超净台中将摇好的菌液倒入灭菌的50mL离心管中，冰浴30min，同时预冷4℃离心机；④菌液4℃4000rpm离心10min，弃上清，吸出残留液；⑤离心管中加入1mL0.1MCaCl2悬浮沉淀后，再加入14mL0.1MCaCl2，振荡混匀，悬浮菌体，冰浴30min；⑥菌液4℃4000rpm离心10min，弃上清，吸出残留液；⑦加入1400µLCaCl2重悬，再加入600µL50%甘油，混匀使甘油终浓度为15%；⑧每管分装50µL，标记，-80℃保存，备用。20 山东农业大学全日制硕士专业学位论文表2-2连接反应体系（10µL）Table2-2MixtureforligationofTrans1-T1Vector（10µL）连接体系10µLTrans1-T1载体2µLPCR回收产物5µL5×TABuffer2µLT4DNAligase1µL（7）连接产物的转化①取连接产物10µL，Top10感受态100µL，冰浴30min；②42℃热激90s；③冰浴5min；④加入890µL液体LB培养基，37℃摇床摇1h；⑤取50µL菌液在Amp+抗性的LB固体培养基均匀涂板；⑥37℃恒温箱过夜培养。（8）菌液PCR在氨苄抗性培养板上挑取单菌落至氨苄抗性LB液体培养基（氨苄：LB=1:1000），37℃200rpm振荡培养4h。菌液PCR反应体系参照蜱虫COI基因的扩增体系。将菌落PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，挑选1-2个比较亮的条带，并将对应的单菌落培养，进行质粒DNA的提取与鉴定。（9）重组质粒DNA的提取挑取生长良好的单菌落，接种到含50mg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃200rpm振荡过夜培养。按照质粒小提试剂盒步骤简述如下：①将过夜培养好的菌液置入1.5mL离心管中，12000rpm离心1min，尽可能的弃掉上清，以收集菌体；②加入250µL4℃预冷的无色溶液RB（含RNaseA），并充分重悬细菌沉淀；21 泰山地区放牧沂蒙黑山羊寄生蜱虫的流行病学调查③加入250µLLB溶液，上下温和地翻转4-6次，使菌体充分裂解，室温静置5min；④加入350µLNB溶液，上下翻转混合5-6次，室温静置2min；⑤12000rpm离心5min，小心的吸取上清，加入到吸附柱中；⑥12000rpm离心1min，倒掉滤出液，重复上述步骤至所有的混合液均被转移，将离心柱重新放到收集管中；⑦加入650µLWB溶液，12000rpm离心1min，弃掉滤出液。⑧将吸附柱开盖离心2min，取出静置数分钟，以除去残留乙醇；⑨将吸附柱置于干净的离心管中，加入40µL的EB室温静置1min。12000rpm离心1min，洗脱DNA，将洗脱出的DNA标记，并于-20℃保存，备用。（10）重组质粒的酶切鉴定采用限制性内切酶XbaI和NotI对重组质粒进行酶切鉴定，建立20uL反应体系如表2-3所示，置于37℃水浴锅中反应3h，用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测酶切情况。表2-3质粒酶切反应体系（20µL）Table2-3Mixtureforrecombinantplasmidwithdigestion（20µL）酶切体系20µL质粒DNA6µLXbaI1µLNotI1µL10×TABuffer2µLddH2O10µL（11）阳性克隆序列测定经上一步双酶切鉴定的阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司进行DNA序列测序。（12）结果识别用BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）软件将目的序列与GenBank中已注册序列进行核对，以识别结果。2.2.2羊群蜱虫感染率记录每个养殖户养殖沂蒙黑山羊的总数，逐只检查羊只是否感染蜱虫，并记录感染22 山东农业大学全日制硕士专业学位论文蜱虫羊只数目。此项工作也在2014年3月至11月进行，期间每月调查两次，每次调查两群放牧沂蒙黑山羊。共36群1331只放牧沂蒙黑山羊，计算每月放牧沂蒙黑山羊蜱虫感染率，感染率=感染蜱虫羊只数/羊只总数×100%。2.2.3蜱虫寄生季节动态每群羊分别随机选取6只成年羊，共计216只放牧沂蒙黑山羊，将羊体分为耳部、头部、背部、腹股沟部、尾臀部和四肢部六个区域，对羊体进行检查，记录沂蒙黑山羊体表各成熟阶段蜱虫—若蜱、幼蜱、成蜱（雌蜱及雄蜱）的数量，出现的时间，观察各成熟阶段种群消长的规律，计算成虫阶段的雌雄寄生性比，统计不同部位蜱虫的寄生百分比。此项调查与羊群硬蜱感染率的调查同步进行。2.2.4蜱虫携带病原的调查依据不同病原的18SrRNA、16SrRNA以及OspA基因引用及设计相应PCR扩增引物（人粒细胞无形体：张志强等，2007；查菲埃里克体:Andersonetal.,1991；Q热：Richardatel.,2013；伯氏疏螺旋体OspA：Isabelleatel.,1995），如表2-4所示。23 泰山地区放牧沂蒙黑山羊寄生蜱虫的流行病学调查表2-4引物序列Table2-4Primersequence病原基因上游引物序列（5’-3’）下游引物序列（5’-3’）退火温度AACGGATTATTCTTTATAGCTTCTCTACACTAGGAATTCCGC粒细胞无形体16SrRNA55℃GCTTATCAATTGCTTATAACCTTTTGGTCAGTATTACCCATCATTTCTA查菲埃立克体16SrRNA50℃TATAAATA贝氏柯克斯体16SrRNAATTGAAGAGTTTGATTCTGGCGGCCTCCCGAAGGTTAG55℃AATAGGTCTAATATTAGCCTTCTAGTGTTTTGCCATCTTCT55℃伯氏疏螺旋体OspAAATAGCTTGAAAA梨形虫18SrRNACCATTCAAGTTTCTGACCAACCGTTCCTATCCATTAC55℃PCR反应体系参照表2-1；DNA模板为蜱虫DNA；基因的克隆和测序参照2.2.1.2蜱虫分子鉴定。24 山东农业大学全日制硕士专业学位论文3结果与分析3.1蜱虫种类3.1.1形态学鉴定结果在体视显微镜下观察蜱虫的形态，如图3-1至3-3所示。饥饿雌虫体形扁平，长4.5mm左右，宽4.5mm左右，饱血雌虫膨胀，呈紫黑色，长可达8mm左右，宽7mm左右，爬行速度缓慢。雌蜱产卵前背部出现逐渐变大的褐色斑块，腹部出现由白色变为褐色的斑块。雄虫体形扁平，长4mm左右，宽3mm左右，盾板黄色带褐色花纹，有刻点，非常光泽，雄虫爬行速度快。该蜱虫成虫形态特征符合血蜱属：体型较小，口器较短，假头基矩形，须肢前窄后宽，外缘弧度大于内缘弧度，盾板颜色单一，无色斑，无侧沟，无眼。体缘垛明显。肛沟围绕在肛门之后。雄蜱腹面无几丁质板。该蜱虫雌虫有如下特征：1、须肢前窄后宽，外缘弧度大于内缘弧度，第2节略长于第3节；2、须肢第2节略超过假头基侧缘；3、须肢第3节背面后缘有三角形刺突；4、盾板近圆形，中部最宽；5、口下板齿式5/5；6、基节2-4内距形状相近（陆宝麟，吴厚永,2003）。对照血蜱属雌蜱分种检索表，经形态学鉴定为长角血蜱(HaemaphysalislongicornisKaiseriana&Neumann,l901）。图3-1雌蜱形态（左：背面右：腹面）Fig.3-1Femaletick(Theleft:backTheright:abdomen)1：须肢；2：假头基；3：盾板；4：生殖孔；5：基节；6：气门板；7：肛门；8：肛沟；9：缘垛1:Palpg;2:Basiscapituli;3:Scutum;4:Genitalopening;5:Coxa;6:Peritremg;7:Anus;8:Analgroove;9:Festoon25 泰山地区放牧沂蒙黑山羊寄生蜱虫的流行病学调查图3-2雌蜱口下板Fig.3-2ThedentalplateofFemaletick1：齿板；2：须肢第3节；3：须肢第2节1:Dentalplate;2:Palpalthirdsection;3:Palpalsecondsection该蜱虫雄虫有如下特征：1、须肢前窄后宽，外缘弧度大于内缘弧度，第2节后外角突出；2、背面观须肢第2节后外角略突出；两侧须肢外缘相合呈钝楔形或亚梯形；3、须肢第3节背刺发达；4、盾板侧沟长；5、足基节2～4内距较短，末端钝；6、须肢第2节背面内缘刚毛2根，腹面内缘刚毛4根（陆宝麟，吴厚永,2003）。对照血蜱属雄蜱分种检索表，该蜱虫为长角血蜱(Haemaphysalislongicornis）。图3-3雄蜱形态（左：背面右：腹面）Fig.3-3Maletick(Theleft:backTheright:abdomen)1：盾板；2：生殖孔；3：气门板；4：肛门；5：肛沟；6：缘垛1:Scutum;2:Genitalopening;3:Peritrem;4:Anus;5:Analgroove;6:Festoon3.1.2分子鉴定结果26 山东农业大学全日制硕士专业学位论文以提取的蜱虫基因组为模板，以设计的长角血蜱线粒体COI基因特异引物PCR扩增相应基因片段。经核酸电泳后，紫外凝胶成像仪显示，出现条带与预期的823bp相符，如图3-4。图3-4长角血蜱线粒体COI基因PCR扩增产物电泳图Fig.3-4PCRproductselectrophoresisofmitochondrialCOIgeneM：DNA分子量Marker；1：空白对照；2：线粒体COI基因的PCR扩增产物M:DNAmolecularweightMarker；1:mockcontrol；2:PCRproductsofmitochondrialCOIgene用BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）软件将目的序列与GenBank中已注册序列进行核对，结果显示该序列（如图3-5）与GenBank中收录的长角血蜱COI基因（GenBank:KF583575.1、FN394334.1、JQ737087.1、AF132820.1、JQ737091.1）同源性为100%，证明所采蜱虫均为长角血蜱。图3-5COI基因测序序列Fig.3-5SequencingsequenceofCOIgene27 泰山地区放牧沂蒙黑山羊寄生蜱虫的流行病学调查长角血蜱为三宿主蜱，在华北地区每年繁殖一代，主要寄生于牛、马、羊、犬和猪等家畜以及野兔、刺猬等野生动物，分布于山东省大部分地区，为泰山山区的优势蜱虫，除了对寄生宿主造成直接损伤外，还能够传播梨形虫（包括泰勒虫、巴贝斯虫）、Q热、无形体、莱姆病等疾病。3.2羊群蜱虫感染率每月羊群蜱虫感染率如表3-1所示。随着温度的升高，长角血蜱在3月份开始活动，之后较为活跃，4月份羊群蜱虫感染很快达到100%，10月份降温后，长角血蜱活动减弱，羊群感染率降低，11月感染率为15%，在11月下旬长角血蜱从羊体表消失。表3-1各月份放牧沂蒙黑山羊长角血蜱感染率Tab.3-1TheH.longicornisinfectionrateofthegoats月份3月4月5月6月7月8月9月10月11月感染率感染率40%100%100%100%100%100%100%60%15%3.3蜱虫寄生期季节动态采用宿主体表调查法，对下港乡放牧的沂蒙黑山羊体表蜱虫进行调查，蜱虫寄生期季节动态结果见图3-6至图3-9。图3-6宿主表寄生期长角血蜱幼虫季节动态Fig.3-6TheseasonalactivityoflarvaH.longicornisonhost28 山东农业大学全日制硕士专业学位论文图3-7宿主表寄生期长角血蜱若虫季节动态Fig.3-7TheseasonalactivityofnymphH.longicornisonhost图3-8宿主表寄生期长角血蜱雌蜱、雄虫季节动态Fig.3-8TheseasonalactivityofadultH.longicornisonhost图3-9宿主体表寄生期长角血蜱雌雄性比Fig.3-9ThesexratioofadultH.longicornisonhost29 泰山地区放牧沂蒙黑山羊寄生蜱虫的流行病学调查由图3-6可以看出，长角血蜱幼蜱在羊体上出现的时间为7月中旬，11月上旬从羊体消失。在此期间，幼蜱的种群数量高峰值出现在9月上旬。由图3-7可以看出，长角血蜱若虫在3月中旬开始活动，叮咬宿主寄生于宿主体表，高峰期出现在4月中旬，在6月下旬明显若蜱数量明显下降，7月中旬在羊体表消失，8月中旬又在羊体表重新出现，在9月中旬再次出现高峰期，但相较于4月份的高峰期，峰值明显下降。之后，在11月份中旬再次从羊体消失。由图3-8可以看出，在整个调查期间，在黑山羊体表都能发现长角血蜱的成虫。在3月至4月上旬检查到的成虫以雄虫居多，但在数量上呈下降趋势，在4月中旬至7月中旬雄蜱数量呈小幅增长趋势，在7月中旬到达高峰值，之后雄虫数量再次呈下降趋势。3月上旬至5月中旬，长角血蜱雌蜱数量相对稳定，在7月中旬到达高峰值，之后急速下降，8月中旬至11月份，雌蜱数量较少，只发现极少数个体。由图3-9可以看出，在4、6、7月份雌蜱数量多于雄蜱，分别为雄蜱的2.36、5.07、3.49倍，在其他月份雌蜱数量少于雄蜱，在整个调查期间，雌蜱与雄蜱的性别比例为2.9:1。3.4沂蒙黑山羊不同部位蜱虫寄生比例对长角血蜱个各发育阶段在黑山羊体表上的寄生部位耳部、头部、背部、腹股沟部、尾臀部及四肢部寄生比例进行调查，其结果如图3-10至图3-16所示，同时对各部位长角血蜱寄生只数采用字母标记法进行方差分析，小写字母表示差异显著(P＜0.05)，其结果如表3-2至3-7所示。表3-2长角血蜱在羊体耳部各月份的方差分析表（xs）Tab.3-2Thevarianceofticksonear月份3月4月5月6月7月8月9月10月11月部位耳部310.6b386.2b316.9b140.1c147.4c446.2b1345.3a17.3d1.3e30 山东农业大学全日制硕士专业学位论文图3-10各阶段长角血蜱在耳部的分布Fig.3-10Distributionofticksonear由表3-2和图3-10所示，9月份耳部长角血蜱数量显著的高于3、4、5、8月份，而3、4、5、8月份的硬蜱数量又显著高于6、7月份，10月份与11月份的长角血蜱数量最少。表3-3长角血蜱在羊体头部各月份的方差分析表（xs）Tab.3-3Thevarianceofticksonhead月份3月4月5月6月7月8月9月10月11月部位头部11.3c17.9bc25.8b47.7a57.3a45.6a41.3ab0d0d图3-11各阶段长角血蜱在头部的分布Fig.3-11Distributionofticksonhead31 泰山地区放牧沂蒙黑山羊寄生蜱虫的流行病学调查表3-4长角血蜱在羊体背部各月份的方差分析表（xs）Tab.3-4Thevarianceofticksonback月份3月4月5月6月7月8月9月10月11月部位背部8.1b9.8b10b21.9a25.2a15.4ab7.8b0.5c0c图3-12各阶段长角血蜱在背部的分布Fig.3-12Distributionofticksonback表3-5长角血蜱在羊体腹股沟各月份的方差分析表（xs）Tab.3-5Thevarianceofticksongroin月份3月4月5月6月7月8月9月10月11月部位腹股沟0d6.8c10.7bc12.6b26.5a11.2b15.5b0d0d32 山东农业大学全日制硕士专业学位论文图3-13各阶段长角血蜱在腹股沟的分布Fig.3-13Distributionofticksongroin表3-6长角血蜱在羊体尾臀部各月份的方差分析表（xs）Tab.3-6Thevarianceofticksonuropygium月份3月4月5月6月7月8月9月10月11月部位尾臀部0.2d6.8bc2.9c13.4b22.4a3.9c6.7bc0.2d0d图3-14各阶段长角血蜱在尾臀部的分布Fig.3-14Distributionofticksonuropygium33 泰山地区放牧沂蒙黑山羊寄生蜱虫的流行病学调查表3-7长角血蜱在羊体四肢部各月份的方差分析表（xs）Tab.3-7Thevarianceofticksonlambs月份部3月4月5月6月7月8月9月10月11月部位四肢0.8d9.9b5.5c10.9bc26.8a28.5a9.2bc0de0de图3-15各阶段长角血蜱在四肢的分布Fig.3-15Distributionofticksonlimbs由以上各表及图可以看出，头部、背部、腹股沟部、尾臀部蜱虫寄生数量均在7月份达到峰值，而四肢部在8月达到峰值；在10月份以后头部、腹股沟及四肢部再无蜱虫寄生，在11月份背部及尾臀部寄生蜱虫消失。在整个调查期间在耳部均可发现长角血蜱，且9月份耳部长角血蜱数量最多，接近1500只蜱虫/耳，其中幼蜱占大多数。从不同部位上看，无论在任何月份，羊体耳部寄生的硬蜱只数均极显著的高于头部，而头部的硬蜱只数显著的高于其他部位（P＜0.05）。34 山东农业大学全日制硕士专业学位论文图3-16羊体不同部位蜱虫寄生百分比Fig.3-16Distributionofticksongoat长角血蜱在放牧沂蒙黑山羊各部位的分布如图3-16所示，长角血蜱寄生于放牧沂蒙黑山羊体表各个部位，耳部、头部、背部、腹股沟部、尾臀部及四肢部，主要分布于耳部，耳部种群寄生百分比最大为84.74%，其次为头部6.26%，尾臀部比例最低为1.54%。可能于耳部毛短，皮肤薄，血管丰富，易于蜱虫的吸血活动有关。3.5气候数据2014年1-12月，各月平均高温、平均低温和平均温度及降雨量数据见图3-17、3-18。图3-172014年1-12月山东省泰山山区月最低、最高和平均温度Fig.3-17Minimun(Tmin),maximum(Tmax)andmean(Tmean)airtemperature(℃)duringtheperiodfromJanuarytoDecemberin2014,Taishanmountainousarea,Shandongprovince,EastChina.35 泰山地区放牧沂蒙黑山羊寄生蜱虫的流行病学调查图3-182014年1-12月山东省泰山山区各月降水量Fig.3-18Themeanrainfall(mm)duringtheperiodfromJanuarytoDecemberin2014,Taishanmountainousarea,Shandongprovince,EastChina.3.6蜱虫数量与外界环境的相关分析根据不同月份的温度与降雨量，以及对应月份的放牧沂蒙黑山羊体表寄生长角血蜱只数，我们采用SPSS16.0的相关分析，进而分析温度与降雨量对长角血蜱在放牧沂蒙黑山羊体表的寄生状况，分析结果见表3-8。表3-8硬蜱个数、温度、降雨量的相关系数表Tab.3-8Therelationshiptablesofnumberofticks、temperatureandrainfall相关性R值硬蜱个数温度湿度硬蜱个数10.6430.815温度0.72310.874降雨量0.8150.8741根据长角血蜱只数、温度、降雨量之间的相关系数表，我们可以看出，泰山山区温度与降雨量具有很强的相关性R=0.874，蜱虫只数与温度以及降雨量均有很强的关联度，相关系数分别为R=0.723，R=0.815。同时，放牧沂蒙黑山羊体表寄生长角血蜱只数受外界环境中的降雨量的影响更大。因此，在外界温度不可控的情况下，保持圈舍干燥，降低圈内环境湿度是减少放牧沂蒙黑山羊体表寄生蜱虫的一个有效途径。3.7蜱虫携带病原的调查以提取的蜱虫基因组为模板，以相应的人粒细胞无形体引物、查菲埃立克体引物、贝氏柯克斯体引物、伯氏疏螺旋体引物以及梨形虫引物PCR扩增相应基因片段。其它反36 山东农业大学全日制硕士专业学位论文应物和反应条件相同的体系作为空白对照。经核酸电泳后，紫外凝胶成像仪显示，病原人粒细胞无形体、查菲埃里克体、贝氏柯克斯体、伯氏疏螺旋体PCR均为阴性，仅梨形虫条带与预期的522bp相符，如图3-19。图3-19病原PCR扩增产物电泳图Fig.3-19PCRproductselectrophoresisofpathogensM：DNA分子量Marker；1：梨形虫；2：粒细胞无形体；3：查菲埃立克体；4：贝氏柯克斯体；5：伯氏疏螺旋体；6：空白对照M:DNAmolecularweightMarker;1:Piroplasms;2:A.phagocytophilum;3:E.chaffeensis;4:C.bumetii;5:B.burgdoferi;6:mockcontrol梨形虫PCR产物经测序，序列如图3-20所示。进行Blast，结果显示该序列与GenBank中收录的吕氏泰勒虫（Theilerialuwenshun，GenBank收录号：KC769996.1、KC769995.1、KC769994.1、KC735154.1、JX469518.1）相对应的片段同源性为100%。提示本地长角血蜱感染吕氏泰勒虫。图3-2018SrRNA测序序列Fig.3-20Sequencingsequenceof18SrRNA各月份蜱虫吕氏泰勒虫感染率如表3-8所示，4月份至9月份，感染率较高，5月份感染率最高达60%。5月份至9月份温度较高，多雨，空气湿度较大，蜱虫的活动频繁并进入繁殖期，有利于蜱传疾病的传播。吕氏泰勒虫为我国常见羊泰勒虫，2007年在甘肃的青海血蜱中发现（殷宏，2007），后证实长角血蜱也为其媒介宿主，感染吕氏泰37 泰山地区放牧沂蒙黑山羊寄生蜱虫的流行病学调查勒虫的的蜱虫在宿主体表吸血时，伴随蜱的唾液腺进入宿主体内立即侵入宿主红细胞，开始发育和繁殖，对宿主造成损伤。表3-8各月份长角血蜱吕氏泰勒虫感染率Tab.3-8TheT.luwenshuninfectionrateoftheH.longicornis月份3月4月5月6月7月8月9月10月11月感染率感染率8%33%60%40%35%25%15%0038 山东农业大学全日制硕士专业学位论文4讨论泰山山区位于山东中南部，属暖温带大陆性半湿润季风气候，空气湿度大，植被资源较为丰富，有利于养羊业的发展。沂蒙黑山羊是山东省农区优良羊种之一，属肉、裘、绒兼用山羊品种，其主要性能优于国内其他山羊，因为全身被毛全黑而得名，耐粗饲、抗病力强，主要分布于鲁中南的泰山、沂山山区，淄博市沂源县是中心产区，并于2009年获得农业部沂蒙黑山羊地理标志认证。沂蒙黑山羊具有体型大、生产性能高和体型外貌较一致等特点（尹逊河等，1997；邢晋祎等，2005；李泰云等，2011）。沂蒙黑山羊肉营养丰富，其肉质高蛋白膻味小的特点受到越来越多消费者的喜爱；山羊绒、板皮也是高档的纺织原料和制革原料；沂蒙黑山羊绒含绒量约为80%，绒毛长平均在18cm以上，纤维细有光泽，毛质柔软，杂质少，脂肪含量。沂蒙黑山羊易于放牧管理，合群性强，能紧跟头羊，神经锐敏，爱清洁，不饮污水，不吃污草，可采食多种野生牧草，全年均可放牧，每只羊每天采食量相当于自身体重的1/10左右，每年需天然草场4.5亩（王岳等，2014）。沂蒙黑山羊抗病力强，发病很少。养殖户准备遮雨羊圈、运动场、盐砖和水盆，就能放牧饲养。20世纪80年代初，沂蒙黑山羊存养量曾最高达到300万只左右（李富宽等，2013），沂蒙黑山羊2014年山东省存栏数达160万只，在泰山山区存栏数达20万只。但近年来全球变暖，节肢动物更加活跃，山东省山区蜱虫较常见，沂蒙黑山羊养殖多为放牧，使羊极易感染蜱虫（陈炳宇等，2014），严重影响羊只的采食、行走和睡卧，研究过程中从羊蹄中找到多只已经饱血的蜱虫，羊只被蜱虫侵袭后耳部脱毛、消瘦、生长迟缓，给畜牧业生产造成很大危害。山东省截止2013年底，共发现蜱类虫有2科（硬蜱科、软蜱科）、8属、14种蜱虫（宋健等，2013），硬蜱种类为长角血蜱、嗜群血蜱、豪猪血蜱、褐黄血蜱、铃头血蜱、微小牛蜱、草原硬蜱、钝跗硬蜱、残缘璃眼蜱、血红扇头蜱、中华革蜱、森林革蜱，其中嗜群血蜱为山东省新发现。2种软蜱分别为波斯锐缘蜱和蝙蝠败蜱。长角血蜱属于山东省的优势蜱种（王丽娟等，2007；许其华，2014）。长角血蜱寄生于牛、羊，还可寄生于野生动物，如刺猬、野兔、鸟类，在其寄生期存在世代重叠现象。泰山地区长角血蜱为优势蜱种，本文蜱虫采集地点位于泰山东麓，同时作者从泰山西麓桃花峪及肥城放牧羊体表均采集到长角血蜱，从泰山犬体表也采集到不同发育阶段的长角血蜱。泰山山区蜱虫以长角血蜱为主，与泰山山脉地理分布和蜱虫活动范围局限有关。山东省山地有蜱虫报道，平原地区少见蜱虫寄生，山东省山脉呈岛屿状分布，周围均为平原，39 泰山地区放牧沂蒙黑山羊寄生蜱虫的流行病学调查限制了蜱虫的传播。泰山方圆426平方公里，位于济南、长清、肥城、泰安之间，与淄博山区相连，山脉之外被平原包围；淄博山区长角血蜱较常见，淄川区土峪村山口处尤为突出，不但严重危害养殖业，而且对当地旅游业造成严重困扰。长角血蜱在寻找宿主时，爬到草叶反面，通常离地10-50cm，待动物路过，迅速攀附到动物毛发上，长角血蜱多数栖息于灌木丛，草丛和阔叶林较少见，针叶林内未检出（郑洪远，2008）。在田间调查中，养殖户多次提示作者，蜱虫活动范围很小，不同放牧路线的羊只被侵袭的程度不一，蜱虫爬行缓慢（除雄蜱），特别是幼虫，如不能遇到宿主（鼠、野鸡、家畜等），会迅速死亡；若虫抵抗力很强，爬行缓慢；雌虫出现在6-7月份，行动非常迟缓。这些因素限制了蜱虫的扩散，造成单一蜱种在局部占据数量优势。长角血蜱是我国常见三宿主蜱，广泛分布于全国各地，如冀鲁豫皖苏台湘鄂晋陕黔滇川藏甘黑吉辽台等，在国外主要分布在朝鲜、日本、俄罗斯远东地区、澳大利亚、新西兰及南太平洋一些岛屿(邓国藩等，1991；陈泽等，2008)。东三省牛体表长角血蜱占48.4%（431/890）（滕立佳，2014）。该虫在不同省份活动高峰期不同，由于气温不同，在山东省6月和7月为雌虫活动高峰，东三省雌虫活动高峰季节4-6月（宋健，周红宁，2013），江西省为5-6月。在温度较高的地方，成虫出现较早，同时消退也早，在枣庄市山区，7月底雌虫数量急剧减少，但在温度较低的烟台地区，8月初仍有雌虫寄生，泰安山区温度较低，8月10日左右仍可在羊体表检出雌虫。本研究采用宿主体表调查法，对寄生于泰山山区放牧沂蒙黑山羊体表的长角血蜱季节动态进行调查，调查数据表明，在寄生期，长角血蜱呈现一定的季节消长规律。在本文整个调查期间，在沂蒙黑山羊体表都能发现长角血蜱的成虫。幼蜱7月份在羊体表活动，9月份达到高峰期。据Yano报道(Yanoetal.,1987)，在15℃、100%相对湿度下，长角血蜱的卵的孵化期是100.8天，然而，在20℃、100%相对湿度下，其孵化期缩短为42.2天。郑洪远（2008）在河北张家口小五台山长角血蜱调查显示：当地长角血蜱3月上旬开始活动，10月中旬从植物上不能检出；幼虫6月下旬孵出，9月上旬数量达到高峰，10月中旬发育为若虫；若虫4月上旬开始出现在植物上，5月上旬呈现高峰，9月中旬从植物上不能检出；成虫在3月上旬至9月下旬出现在植物上，数量高峰在7月上旬，9月下旬成虫从植物上不能检出；植物上采集的成虫雌雄性比为0.85：l；小五台山长角血蜱幼虫7月上旬出现在羊体表，数量高峰在9月上旬，10月中旬从羊体上不能检出；若虫在3月中旬出现在羊体表，数量高峰在4月下旬，9月上旬从羊体上不能检出；长角血蜱成虫于羊体表数量高峰在7月中旬，雌虫从4月上旬至10月上旬在羊40 山东农业大学全日制硕士专业学位论文体表寄生。雌虫与雄虫的性别比例为0.43：l。河北山区气温略低于泰安地区，本文所调查的泰山山区，从植物开花滞后情况看，气温也略低于泰安市区，泰安市7月份环境温度上升到20℃以上，降雨量充沛，相对湿度较大，这样的环境条件利于蜱虫卵的发育，因此在本文所调查的泰山山区，幼蜱在7月上旬开始活动，但数量较低，7月份温度进一步升高，降雨量加大，相对湿度也增大，卵的孵化期进一步缩短，在9月中旬达到高峰期，之后随着温度的降低和降水量的减少，相对湿度降低，不利于幼蜱的活动，其数量快速降低，并在10月中旬从羊体表消失。若蜱于3月份开始在羊体表活动，4月份迅速达到高峰期，之后在9月份出现一次较小的高峰期；长角血蜱成蜱于3月上旬开始在沂蒙黑山羊体表活动，雌蜱和雄蜱数量均在7月份达到峰值，之后在11月份均少量寄生于宿主。长角血蜱以成蜱和若蜱的形态越冬，在3月份温度升高时，开始活动，寻找宿主，4月份若蜱迅速达到峰值，之后从宿主体表脱落，蜕皮为成蜱，数量减少，9月份时部分幼蜱发育为若蜱再次出现在沂蒙黑山羊体表，之后以若蜱形态越冬。6至8月份，温度高，湿度大，环境条件利于蜱虫的生长与繁殖，雌蜱饱血后从宿主体表脱落，产卵，数量下降。一般经过2-3周，卵便孵化为幼蜱。一年当中，三种虫态各有一个活动高峰期。本文调查数据显示，在本文所调查的泰山地区，长角血蜱一年只发生一世代，该结果与孔繁瑶（2010）的报道相符。在整个调查期间，雌蜱与雄蜱的比例为2.9:1，也有可能是因为雄蜱个体较小且活动灵敏，以致在感受到外界变化时，迅速从原来的寄生部位转移至其他位置吸血，而雌蜱个体较大，活动灵敏性相对较低，其在吸血过程中，不离开原叮咬点，直至饱血后从宿主上脱落下来。郑洪远（2008）在河北张家口小五台山长角血蜱调查显示：长角血蜱幼虫在羊体表主要寄生于耳部80%、腹部9%、下颌5%、眼睑3%、鼠蹊2%和腋下1%，若虫的寄生部位主要有耳部85%、眼睑8%、下颌3%、腹部3%和鼠蹊1%，成虫的寄生部位主要有耳部65%、下颌25%、眼睑7%和鼠蹊3%，幼虫、若虫、成虫在耳部荷虫高达65-80%以上。在本文所调查的泰山山区，也出现类似结果，长角血蜱在黑山羊体表的主要寄生部位为耳部，其次为头部和背部。这有可能是因为耳部皮肤较薄且血管较丰富，温度较高，有利于蜱虫的行动及吸血活动。幼蜱和若蜱个体较小，在耳部寄生种群数量巨大，且多寄生在耳缘血管部位。成蜱在宿主体表各个部位均有分布，常见于耳部、角根、下颌部、眼睑部和公羊鼠蹊部。在整个调查阶段，沂蒙黑山羊耳部长角血蜱的种群密度均高于其他部位。41 泰山地区放牧沂蒙黑山羊寄生蜱虫的流行病学调查长角血蜱是重要的媒介节肢动物。2000年（王丽娟等）首次从病原学上证实山东省山林地区存在莱姆病的自然疫源地。发现山林地区人群莱姆病的平均感染率为6.25%；并在长角血蜱中检测到中国莱姆病螺旋体，但泰安地区人群血清学检查无阳性。我国在Q热调查工作中，分离出贝氏柯克斯体的蜱有亚洲璃眼蜱(H.asiaticumasiaticum)、铃头血蜱(H.campanulata)、微小牛蜱(B.microplus)、亚东璃眼蜱(H.asiaticumkozlovi)（张军民，2010）。目前，没有从长角血蜱中分离出Q热病原的报道。我国近年的调查资料显示，多种、属硬蜱可携带人粒细胞无形体。在全沟硬蜱（I.persulcatus）、嗜群血蜱（H.concinna）、森林革蜱（D.silvarum）、草原革蜱（D.nuttalli）及长角血蜱（H.longicornis）中检测到人粒细胞无形体（YuZ,2015）。长角血蜱是泰安地区优势蜱种。于强等人（2012）调查结果显示，山东莱州湿地长角血蜱无形体检测阳性率为43.5%，但本研究未能在泰山山区的长角血蜱中为检查到该病原。羊泰勒虫病（ovineandcaprinetheileriosis）是由媒介蜱虫传播的由泰勒科泰勒属的原虫寄生于绵羊和山羊巨噬细胞、淋巴细胞和红细胞内所引起的疾病的总称，是一种蜱传性血液原虫。本病最早由Littlewood（1914）发现于埃及的绵羊其病原为病原为绵羊泰勒虫（Theilerovis），目前亚洲、非洲、欧洲等地均该病有发生和流行的报导。我国在四川甘玫藏族自治州的花宁县境内确诊本病（杨辅国等，1958），随后在甘肃、青海、宁夏、内蒙古、辽宁、四川、陕西以及新疆等地也有该病流行的报道。该病主要呈地方性流行并且危害严重，除可引起羔羊的大量死亡外，还可以使慢性发病羊只发育迟缓，产肉量以及产毛量均显著下降，从而给养羊业造成重大的经济损失。目前国内外已经报道的羊泰勒虫有6个种，其中以尤氏泰勒虫（Theileriauilenbergi）和莱氏泰勒虫（T.lestoquardi）的致病力最强，吕氏泰勒虫（T.luwenshuni）次之，而绵羊泰勒虫（T.ovis）、隐藏泰勒虫（T.recondita）和分离泰勒虫（T.separata）致病性很弱或无致病性（Uilenberg1981;Alanietal.,1988;Ahmedetal.,2006;Yin,2007）。在我国，已报道的羊泰勒虫病的病原有尤氏泰勒虫、吕氏泰勒虫和绵羊泰勒虫。吕氏泰勒虫为我国常见羊泰勒虫，殷宏等人（Yinetal.,2007）年在甘肃的青海血蜱中发现，后经证实长角血蜱也为其媒介宿主（LiYQetal.,2007），感染吕氏泰勒虫的的蜱在宿主体表吸血时，伴随蜱的唾液腺进入宿主体内，之后侵入宿主红细胞，开始发育和繁殖，对宿主造成损伤。试验证明，长角血蜱幼蜱和若蜱叮咬感染吕氏泰勒虫的羊，并饱血且进一步发育为长角血蜱若蜱和成蜱后，能分别传播泰勒虫给除脾绵羊（李有全，2007）。有研究显示各月份长角血蜱吕氏泰勒虫的感染率不同，5月份感染率最高为60%，10月和11月无42 山东农业大学全日制硕士专业学位论文感染，羊泰勒焦虫病在每年的春季和秋季多发，春季始于3月，4-5月为发病高峰期，以后逐渐停息；秋季于8月发病，但发病数较少（杨毛吉，2006；李伟，2007）。发病时期的早迟与当年的气温高低有关，即与蜱的吸血活动有关。此外，在羊血中也检测到吕氏泰勒虫。本文是首次在山东泰山山区的长角血蜱中检测到吕氏泰勒虫，从而证实本地存在该病原疫源地。其他学者也从各地检测出吕氏泰勒虫。LiY等从从内蒙古牧区220只侵袭羊只的长角血蜱DNA中，PCR扩增吕氏泰勒虫18SrRNA基因，阳性率为72%（LiY,ZhangX,LiuZ,2014）。LiY等从内蒙古牧区120只长角血蜱DNA中，PCR扩增吕氏泰勒虫18SrRNA基因，阳性率为80%（LiY,ChenZ,LiuZ,etal.,2014）。PCR扩增吕氏泰勒虫18SrRNA，从湖北山羊寄生的长角血蜱检出率为82%(41/50)（李有全等，2012）。YangY等用荧光定量PCR，从浙江172份长江三角洲白山羊血样中，检测出116份吕氏泰勒虫阳性，阳性率为67.4%；从新疆98份新疆山羊血样中，检测出4份吕氏泰勒虫阳性，阳性率为4.1%；从山东39份泗水裘皮羊血样中，检测出23份吕氏泰勒虫阳性，阳性率为59%(Yangetal.,2014)。陈丽凤等从河北省新乐市31份羊血液样本中，用巢式PCR检测出4份吕氏泰勒虫阳性样本，阳性率为12.9%，同时中华泰勒虫、尤氏泰勒虫、羊巴贝斯虫未检出（陈丽凤等，2012）。Ge等（2012）浙江省100份羊血液样品巢式PCR扩增泰勒虫18SrRNA序列，在26份血液样品检出泰勒虫，且全为吕氏泰勒虫。刘庆（2013）采用LAMP，从甘肃的样品中同时检出了吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫，还有二者共感染；广东、贵州、重庆检出吕氏泰勒虫，广西未发现羊泰勒虫。自首次发现羊泰勒虫病以来，人们对羊泰勒虫病的综合防控研究从未间断过。泰勒虫、媒介蜱虫以及宿主是羊泰勒虫病传播与发展的必备环节。通常对于一种疾病的防治采取药物治疗和疫苗免疫两种措施。然而药物治疗可引起耐药性、药物残留，肉品和环境污染等问题，此外蜱虫的反复叮咬又可导致羊泰勒虫病的频发，目前传统的化学药物治疗方法不能从根本上控制该病。因此疫苗防治就成了最具发展前景的防治措施。因为吕氏泰勒虫无法在体外大量培养，不能用来研制强毒或弱毒疫苗，所以，研制好的基因工程疫苗便成为羊泰勒虫病疫苗防治的惟一希望（张宝等；2009）。而对于羊血液细胞内的羊泰勒虫裂殖子阶段的基因及其保护性抗原的研究，通常也只能从羊血液细胞分离和纯化羊泰勒虫裂殖子，进而构建羊泰勒虫裂殖子cDNA表达文库，从中筛选抗原基因，目前该法已成为筛选梨形虫抗原候选基因的一种有效的方法。李有全等（2009）选用OligotexDirectmRNAKit和OrientExpresscDNALibraryConstructionSystems成43 泰山地区放牧沂蒙黑山羊寄生蜱虫的流行病学调查功构建了吕氏泰勒虫裂殖子cDNA表达文库，其初级库容量约为1.0×106PFU，文库重组率为100%，该基因文库为研究泰勒虫疫苗、新型医药和诊断抗原，以及发展可持续性防制羊吕氏泰勒虫病提供了基本材料。真核生物核糖体的小亚基RNA染色体基因编码，称为18SrRNA基因，是寄生原虫种类鉴别和系统发育研究中常常选用的靶基因。因其进化速度极慢，在漫长的生物进化过程中，它的一级结构和二级结构基本格局变化极少，平均一亿年仅变化5.5%，是迄今发现的DNA序列中最为保守的一类。因此，18SrRNA基因为分类学研究提供了极有价值的材料。OspA基因是伯氏疏螺旋体的主要外膜蛋白之一，其在体内和体外均可以高效表达。OspA是一种粘附素，它对螺旋体在蜱虫中肠中的定居有重要作用，缺乏该蛋白时，伯氏疏螺旋体无法在蜱虫体内存活。而且伯氏疏螺旋体的OspA与其他微生物如钩端螺旋体、梅毒螺旋体以及赫氏疏螺旋的交叉反应较低，因此，其分子诊断及流行病学研究方面有重要意义。由于16SrRNA的高变区具有细菌属、种的特征，因此16SrRNA序列测定以成为细菌分类和鉴定的标准之一，16SrRNA序列分析是确定细菌系统发生关系的最有效和最迅速的方法之一，尤其是对于严格细胞内寄生菌的发现提供了准确快速的方法。因此选用以上基因进行病原体的检测。44 山东农业大学全日制硕士专业学位论文5结论1.2014年泰山山区放牧沂蒙黑山羊体表寄生蜱虫为长角血蜱。2.长角血蜱在放牧沂蒙黑山羊体表的活动具有季节性，7、8月份为长角血蜱活动高峰期，达1400只蜱虫/羊，羊体表各部位均有分布，耳部种群分布密度最大最大为84.74%。3.经PCR检测结果显示该地区长角血蜱未感染贝氏柯克斯体、粒细胞无形体、查菲埃立克体和伯氏疏螺旋体，但感染吕氏泰勒虫，春夏季节感染率较高，5月份感染率最高为60%，具有季节性。45 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山东农业大学全日制硕士专业学位论文2008,300(19):2263-227053 泰山地区放牧沂蒙黑山羊寄生蜱虫的流行病学调查致谢值此论文完稿之际，首先向尊敬的导师李宏梅副教授和赵孝民教授致以最崇高的敬意和诚挚的感谢。感谢导师两年来始终给予的支持、理解和鼓励。本论文是在导师李宏梅副教授和赵孝民教授的悉心指导下完成的。导师在科研上的执着、严谨、勤奋深深的影响着我。同时导师高尚的科学素养，豁达宽广的胸怀，诲人不倦的为师之道培养了我对科研的热情，坚定了我从事科研的信心，也将是我努力的榜样和目标。导师提供了良好的学术氛围和优越的科研条件使我提升了自己的学习能力，掌握了丰富知识，学习了实验技能，培养了我科学的思维。感谢导师对我的成长倾注的大量心血和无私的关怀，师恩铭记于心。衷心感谢动物医学院预防兽医系的崔治中教授、姜世金教授，柴同杰教授、崔言顺教授、朱瑞良教授、刁有祥教授、常维山教授、孙淑红副教授，柴家前副教授，胡敬东副教授等老师对我的培养和教诲！在此对他们表示深深的谢意！本实验在山东农业大学流行病及病原生物学实验室完成，衷心感谢指导和帮助过我的王方昆老师，感谢师兄（姐）孙慧、陈正涛、徐晴晴、崔宁、王龙江、吕俊峰、孙静静、姜夕玥、汪晓飞、何菲菲、张怡聪的大力指导和支持，感谢同级王琪、王加众、马兴江、韩林臻、谭刘刚、张民霞及师弟（妹）赵宁宁、刘旭等在试验和实验室工作中给予的无私帮助和支持！感谢父母和家人，是他们的理解和各方面的全面支持，我才得以顺利完成研究生阶段的学业；感谢一直陪伴我的朋友们，他们的理解与付出给予了我前进的动力。感谢生命中出现的每一个人，他们都是命运最好的安排！54 山东农业大学全日制硕士专业学位论文发表论文Co-expressionofEtMic2proteinandchickeninterleukin-18forDNAvaccineagainstchickencoccidiosis.ResearchinVeterinaryScience.2014.pii:S0034-5288(14)00148-9.55
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