《慢性阻塞性肺疾病合并烟曲霉感染巨噬细胞炎症反应调控机制研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
博士学位论文（同等学力）慢性阻塞性肺疾病合并烟曲霉感染巨噬细胞炎症反应调控机制研究StudyonRegulatoryMechanismofMacrophageInflammatoryReactioninChronicObstructivePulmonaryDiseaseTreatedwithAspergillusfumigatusInfection专业名称：内科学（呼吸病学）研究生姓名：张鹏鹏导师姓名：施毅教授培养单位：第二军医大学南京临床学院二〇一七年五月 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究一典果。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明的法律责任。９学位论文作者签名：丨日期：〇年〔月）日＿＞＾学位论文版权使用授权声明本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定，第二军医大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权第二军医大学可以将学位论文全文或部分内容编入《中国学位论文全文数据库》、《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》等数据库进行检索。可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）广：学位论文作者签名：导师签名》？日期：７年ｒ月￥日日期：年月日＞〇ｉｊ３ 目录中文摘要.................................................................................................................1英文摘要.................................................................................................................3缩略词表.................................................................................................................5前言.........................................................................................................................7第一部分...............................................................................................................12引言....................................................................................................................12材料与方法.......................................................................................................15结果....................................................................................................................21讨论....................................................................................................................22小结....................................................................................................................25第二部分...............................................................................................................27引言....................................................................................................................27材料与方法.......................................................................................................30结果....................................................................................................................41讨论....................................................................................................................53小结....................................................................................................................56 总结.......................................................................................................................54参考文献...............................................................................................................55文献综述...............................................................................................................67附录.......................................................................................................................77致谢.......................................................................................................................78 慢性阻塞性肺疾病合并烟曲霉感染巨噬细胞炎症反应调控机制研究摘要第一部分：慢性阻塞性肺疾病患者巨噬细胞的功能及受体表达的相关性研究研究慢性阻塞性肺病（COPD）患者气道巨噬细胞功能变化及其与受体表达的相关性。将COPD患者84例按病情分为轻中度组44例，重度组40例，选取同期健康体检者40例作为对照组，获取3组诱导痰，分离痰巨噬细胞，检测3组吞噬荧光标记曲霉孢子的吞噬指数（PI），采用实时定量反转录PCR法检测3组吞噬相关受体的表达。结果：轻中度组与重度组细胞总数均多于对照组，而巨噬细胞比例却显著下降（P<0.05）；轻中度组与重度组巨噬细胞吞噬功能均受到抑制，3组PI比较差异有统计学意义（P<0.05）；3组巨噬细胞胶原结构清道夫系统（MARCO）、清道夫受体A1（SR-A1）表达量比较差异不明显（P>0.05）；轻中度组与对照组Toll样受体4（TLR4）表达量比较差异不明显，但重度组TLR4表达上调，与轻中度组、对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）；3组MUC5A、AQP5表达量比较差异显著（P<0.05）；巨噬细胞PI与TLR4、黏蛋白5AC（MUC5A）表达量呈负相关（P<0.05），与水通道蛋白5（AQP5）表达量呈正相关（P<0.05）。COPD患者巨噬细胞占细胞总数的比例下降，其吞噬功能也受到抑制，其机制可能与TLR4、MUC5A表达上调及AQP5表达下调等有关。第二部分HMGB1介导烟曲霉孢子引起的COPD小鼠气道巨噬细胞的炎症反应慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种慢性炎性疾病，近年来烟曲霉感染COPD患者的发病率和死亡率有所增加。可能介导各种细胞外炎症反应的HMGB1在COPD患者中增加。本研究的目的是调查HMGB1在烟曲霉感染COPD小鼠中肺泡巨噬细胞的作用和机制。本研究通过用烟草吸烟的方法诱导患有COPD小鼠，用HE染色法检测肺组织病理变化。从支气管肺泡灌洗液中分离出的肺泡巨噬细胞用烟曲霉分生孢子感染，然后通过实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测HMGB1的表达。烟曲霉感染COPD小鼠的肺泡巨噬细胞中HMGB1的敲低后，TNF-、IL-1、IL-6和IL-33mRNA以及细胞因子水平表达均明显升高。利用TLR2/4和Dectin-1siRNA进一步验证了HMGB1通过TLR2/4和Dectin-1受体诱导的炎症反应。我们还探讨了HMGB1对MyD88/NF-B和syk/PI3K信号通路的影响。在烟曲霉感染后COPD小鼠的肺泡巨噬细胞中，HMGB1的表达显着增加。HMGB1，TLR2/4或Dectin-1siRNA促炎细胞因子表达显着降低。HMGB1siRNA降低Dectin-1和TLR2/4的水平，而不-1- 第二军医大学博士学位论文是RAGE水平。此外，MyGB88，p-p65，p-syk和PI3K的表达下降，HMGB1siRNA增加IB。总之，HMGB1通过激活MyD88/NF-B和syk/PI3K信号通过Dectin-1和TLR2/4受体，负责烟曲霉诱导的COPD肺泡巨噬细胞炎性反应。关键词：COPD，巨噬细胞，吞噬作用，烟曲霉，HMGB1，炎症反应-2- 慢性阻塞性肺疾病合并烟曲霉感染巨噬细胞炎症反应调控机制研究AbstractTheRelationshipofMacrophageFunctionwithReceptorExpressioninPatientswithChronicObstructivePulmonaryTostudyairwaymacrophagesfunctionchangesanditsrelationshipwithreceptorexpressioninpatientswithCOPD.84patientswithCOPDinourhospitalbetweenJanuary2015andMarch2016weredividedintothemild-moderategroup(44cases)andtheseveregroup(40cases),andselected40healthypeopleasthecontrolgroup.Weobtainedtheinducedsputumfromthethreegroups,separatedmacrophage,anddetectedthephagocyticindex(PI)offluorescenttagedaspergillusspores.Real-timequantitativereversetranscriptionPCRmethodwasusedtodetecttheexpressionofrelatedgenesof3groups.Results:Thetotalnumberofcellsinmild-to-moderategroupandseveregroupweremorethaninthecontrolgroup,butthemacrophagesratiohaddroppedsignificantly(P<0.05).Allthephagocytosisofmacrophagewererestrainedinmild-to-moderategroupandseveregroup.PIofthreegroupshadstatisticallysignificantdifference(P<0.05).ThedifferenceinexpressionquantityofMacrophageSRwithcollagenousstructure(MARCO)andScavengerreceptor-A1(SR-A1)hadnostatisticalsignificancebetweenthethreegroups(P>0.05).Toll-likereceptors-4(TLR4)expressionquantityinmild-to-moderategroupshowednostatisticallysignificantdifference,whencomparedwithcontrolgroup,butthatinseveregroupwasupregulatedandhadsignificantdifferencewiththoseofthemild-to-moderategroupandthecontrolgroup(P<0.05).MUC5AandAQP5expressionquantityalsoshowedstatisticallysignificantdifferencesbetweenthreegroups(P<0.05).MacrophagesPIwasnegativelycorrelatedwiththeexpressionquantityofTLR4andMUC5A(P<0.05),butpositivelycorrelatedwiththeexpressionquantityofAQP5(P<0.05).PatientswithCOPDhadtheproportionofmacrophagesdecreasedandthephagocytosisfunctionrestrainedasmoregreatlyasthediseasewasaggravating.Itsmechanismmayberelatedtotheup-regulationofTLR4andMUC5Aexpressionanddown-regulationofAQP5expression.HMGB1MediatesAspergillusfumigatus-inducedInflammatoryResponseinAlveolarMacrophagesofCOPDMice-3- 第二军医大学博士学位论文Chronicobstructivepulmonarydisease(COPD)isachronicinflammatorydiseaseandtheincidenceandmortalityofAspergillusfumigatus(A.fumigatus)infectedCOPDpatientsincreasinginrecentyears.HMGB1,whichcouldmediatevariousextracellularinflammatoryresponses,increasedinCOPDpatients.TheaimofthisstudywastoinvestigatetheroleandmechanismofHMGB1inA.fumigatusinfectedalveolarmacrophagesofCOPDmice.Inthisstudy,COPDmicewereestablishedbycigarettesmokingandthepathologicalchangesinthelungtissuesweredetectedbyHEstaining.ThealveolarmacrophagesisolatedfromthebronchoalveolarlavagefluidwereinfectedwithA.fumigatusconidiaandthentheexpressionofHMGB1wasassayedbyReal-timePCRandWesternblot.Thelevelsofpro-inflammatorycytokines(TNF-α,IL-1β,IL-6andIL-33),whichwasconfirmedbyTLR2/4orDectin-1siRNA,RAGE,Dectin-1,andTLR2/4wereassayedafterknockdownofHMGB1inA.fumigatusinfectedalveolarmacrophagesofCOPDmice.WealsoexploredtheeffectsofHMGB1onMyD88/NF-κBandsyk/PI3Ksignalingpathways.HMGB1expressionwassignificantlyincreasedinthealveolarmacrophagesofCOPDmiceafterinfectionwithA.fumigatus.Thepro-inflammatorycytokineexpressionwasremarkablyreducedbyHMGB1,TLR2/4orDectin-1siRNA.ThelevelsofDectin-1andTLR2/4,butnotRAGEweredecreasedbyHMGB1siRNA.Furthermore,theexpressionofMyD88,p-p65,p-syk,andPI3KwasdecreasedandIκBincreasedbyHMGB1siRNA.Inconclusion,HMGB1isresponsibleforA.fumigatus-inducedinflammatoryresponseinCOPDalveolarmacrophageviaDectin-1andTLR2/4receptorthroughactivatingMyD88/NF-κBandsyk/PI3Ksignaling.KEYWORDS：COPD,Macrophages,Phagocytosis,Aspergillusfumigatus,HMGB1,inflammatoryresponse-4- 慢性阻塞性肺疾病合并烟曲霉感染巨噬细胞炎症反应调控机制研究缩略词表英文缩写英文全称中文全称COPDChronicObstructivePulmonaryDisease慢性阻塞性肺病AMalveolarmacrophages肺泡巨噬细胞IL1βinterleuki1β白介素1βIL6interleuki6白介素6IL8interleuki8白介素8IL10interleuki10白介素10TNF-αTumornecrosisfactorα肿瘤坏死因子MIFMacrophagemigrationinhibitoryfactor巨噬细胞迁移抑制因子HIF1αHypoxiainducingfactoralpha1α缺氧诱导因子1αNFκBNuclearfactorkappaB核因子-κBTLR9Toll-likereceptor9Toll样受体9IL36γinterleuki36γ白介素36γIFN-γinterferonγ干扰素γHMGB1highmobilitygroupbox-1protein高迁移率族蛋白MyD88myeloiddifferentiationfactorprotein88髓样分化初级应答蛋白88DAMPsDamageAssociatedMolecularPattern损伤相关分子模式MoleculesAECairwayepithelialcells小气道上皮细胞TGF-βTransforminggrowthfactor-β转化生长因子-βTLRsToll-likereceptorsToll样受体MARCOMacrophageSRwithcollagenousstructure巨噬细胞胶原结构清道夫系统SR-A1Scavengerreceptor-A1清道夫受体A1MUC5ACMucin5AC黏蛋白5ACAQP5Aquaporin5水通道蛋白5LPSlipopolysaccharide脂多糖TLR4Toll-likereceptor4Toll样受体4TLR2Toll-likereceptor2Toll样受体2TLR5Toll-likereceptor5Toll样受体5TLR9Toll-likereceptor9Toll样受体9MSR1Macrophagescavengerreceptor1巨噬细胞清道夫受体1-5- 第二军医大学博士学位论文SR-AclassAscavengerreceptorsA类清道夫受体SRscavengerreceptors清道夫受体Nrf2transcriptionfactornuclearerythroid–related核转录相关因子2factor2MUCMucin子集粘蛋白MUC5ACMucin5AC子集粘蛋白5ACMUC5BMucin5B子集粘蛋白5BAQPaquaporin水通道蛋白AQP5aquaporin5水通道蛋白5IPAinvasivepulmonaryaspergillosis侵袭性肺曲霉病MIP-1αmacrophageinflammatoryprotein1α巨噬细胞炎症蛋白PI3Kphosphatidylinositol3-kinase磷脂酰肌醇3-激酶DAMPsDamageAssociatedMolecularPattern损伤相关分子模式MoleculesPRRpattern-recognizingreceptors模式识别受体RAGEReceptorforAdvancedGlycation晚期糖基化终产物受体End-productRLRsRIG-I-likereceptorsRIG-I样受体NOD1sNOD1-likereceptorsNOD1样受体AIM2sAIM2-likereceptorsAIM2样受体VEGFVascularendothelialgrowthfactor血管内皮生长因子AGERAdvancedGlycosylationEnd-Product高级糖基化最终产物特定SpecificReceptor的受体ROSreactiveoxygenspecies活性氧TLRToll-likereceptorToll样受体PRPsproline-richproteins细胞壁结构蛋白家族PAMPpathogen-associatedmolecularpatterns病原相关分子模式IRAKIL-1RassociatedkinaseIL-1R相关蛋白激酶IFNinterferon干扰素-6- 慢性阻塞性肺疾病合并烟曲霉感染巨噬细胞炎症反应调控机制研究前言慢性阻塞性肺病（ChronicObstructivePulmonaryDisease，COPD）是一种慢性炎症性疾病，以肺功能进行性恶化、持续性气道炎症为特征[1]，主要表现为慢性炎症，细胞外基质破坏和气道上皮细胞凋亡增加，COPD通常还伴随心血管疾病，骨骼肌肉功能障碍，骨质疏松，代谢综合征，抑郁症，肺癌等并发症。COPD是世界上呼吸道相关疾病发病和死亡的主要原因[2]，数据显示2020年预计COPD将发展为人类第三大死亡原因以及世界第五大最常见的致残原因[3]。长期以来，COPD的发病机制不明确，环境风险因素如吸烟一直被认为是COPD发展的必要条件，研究表明吸烟导致肺中的两个病理生理过程发生改变，第一是肺实质蛋白水解破坏，导致空间的永久性扩大即肺气肿，并导致肺弹性损失及气流受限[4-5]，肺气肿是COPD发病率及死亡率的主要原因[6]。第二是小气道的固定狭窄和闭塞以及肺泡壁破坏，其特征是水肿，粘液分泌过多和外周气道纤维化[7]。通常COPD普遍与吸烟直接相关，但是也发现只有少数吸烟者出现临床明显的COPD，而不吸烟者也可能发展为慢性气流受限[8]，所以COPD的风险因素是复杂多样的，不同个体可能受差异遗传背景和其他因素暴露的影响，如有机和无机粉尘、化学试剂和烟雾等[9]都可能是导致COPD发生的原因。COPD中气道重塑和肺实质性结构破坏是气道炎症发生的主要结果。此外，近年来随着环境的恶化以及抗菌范围广泛的抗生素的应用，COPD患者的气道常常被具有潜在致病微生物“定殖”[10]，进一步导致气道炎症增加[11]。一般认为细菌和病毒是导致COPD恶化的主要原因，其中引起肺部真菌感染最常见的真菌属是引起侵袭性曲霉病的病原体即烟曲霉（Aspergillusfumigatus）[12]。在免疫受损的COPD患者中的宿主防御系统损伤可能会增加真菌感染的易感性，研究也显示13％的COPD受试者对烟曲霉出现超敏化反应，并且与肺功能降低有关[13]。然而在现阶段，真菌感染诱发的COPD中炎症反应相关的免疫机制却了解甚少。炎症反应在抗真菌的保护性免疫中起重要作用，巨噬细胞作为最丰富的免疫细胞同时也是肺脏防御系统的重要组成部分，其广泛分布于COPD肺泡及气道表面，通过吞噬炎性细胞和分泌细胞因子调节及引发局部免疫炎症反应[14]。研究发现巨噬细胞释放的化合物包括活性氧，趋化因子，炎症细胞因子，平滑肌收缩器，粘液腺激活剂、细胞外基质蛋白、基质金属蛋白酶家族[11]。这些蛋白质可以将类似的蛋白质降解，并且促进白细胞迁移渗入损伤的组织。其中肺泡巨噬细胞（alveolarmacrophages，AM）通过活化和释放炎性细胞因子从而参与肺部炎症，这是COPD的主要病理生理学特征[15]。此外肺泡巨噬细胞协同嗜中性粒细胞等可以去除曲霉菌，这种针对烟曲霉分生孢子的巨噬细胞吞噬过程是先天宿主防御的一个不可或缺的方面。-7- 第二军医大学博士学位论文例如Opsonization等的研究表明烟曲霉感染后炎症条件下巨噬细胞细胞因子中白介素1（interleuki1，IL1）、白介素6（interleuki6，IL-6）、白介素8（interleuki8，IL-8）、白介素10（interleuki10，IL-10）和肿瘤坏死因子（Tumornecrosisfactor，TNF-）释放减少。而L-纤维胶凝蛋白可以通过调理作用提高巨噬细胞等对烟曲霉分生孢子的摄取能力、增强巨噬细胞的杀灭作用并引发抗炎细胞因子的应答[16]。此外Bidula等研究表明烟曲霉感染后血清调理素纤维胶凝蛋白-A（Ficolin-A）可以增强宿主真菌的相互作用并调节巨噬细胞细胞因子表达，主要是因为Ficolin-A通过调理作用显著增强分生孢子的缔合，同时还抑制菌丝生长，并且增加巨噬细胞对真菌的杀伤能力，所以纤维胶凝蛋白A在功能上与人L-纤维胶凝蛋白相当，均能够通过调节对烟曲霉的先天免疫应答过程从而下调细胞因子的产生，在气道免疫中发挥重要的作用[17]。研究表明感染结果的关键决定因素是促炎和抗炎细胞因子之间的平衡状态。如作为许多细胞因子的上游调节剂，巨噬细胞迁移抑制因子（Macrophagemigrationinhibitoryfactor，MIF）可以通过控制下游相关促炎症细胞因子和抗炎细胞因子的产生，帮助宿主对抗侵袭性烟曲霉的感染[18]。骨髓来源性缺氧诱导因子1α（Hypoxiainducingfactoralpha1α，HIF1α）是哺乳动物内控制代谢，响应炎症以及低氧性先天免疫转录因子。先前的研究表明，在人类真菌病原体烟曲霉感染期间，肺内发生缺氧微环境。利用骨髓缺HIF1α小鼠实验发现HIF1α是烟曲霉肺部攻击后真菌清除所需蛋白，是生存和真菌清除早期后与烟曲霉稳定肺部攻击HIF1α蛋白肺部攻击所需，所以HIF1α有望作为特定免疫抑制真菌感染的治疗目标[19]。钙调神经磷酸酶抑制剂的移植者是感染侵袭性真菌的高风险人群，钙调神经磷酸抑制剂他克莫司可以通过抑制巨噬细胞炎症反应从而干扰气道清除主要霉菌病原体烟曲霉。我们发现钙调神经磷酸-NFAT的激活是吞噬依赖性过程，并可以与核因子B（NuclearfactorkappaB，NF-B）协作生产TNF-。对于酵母聚糖颗粒，通过吞噬性Dectin-1脾酪氨酸激酶途径可激活巨噬细胞钙调磷酸酶-FNAT通路，但烟曲霉的活化需通过吞噬体Toll样受体9（Toll-likereceptor9，TLR9）依赖性和布鲁顿酪氨酸激酶依赖性信号通路发生。这些发现鉴定了巨噬细胞TLR9-BTK-钙调神经磷酸酶-FNAT信号通路的抑制可作为导致器官移植相关性侵袭性曲霉病的关键免疫缺陷[20]。Gresnigt等的研究显示白介素36γ（interleuki-36γ，IL-36γ）可被活的烟曲霉分生孢子和热灭活的菌丝显著诱导，而IL-36受体拮抗剂可被热灭活的分生孢子，菌丝和活分生孢子显著诱导。并且IL-36γ的表达依赖于dectin-1/Syk和TLR4信号通路。相比之下，Toll样受体2和CR3抑制IL-36γ表达。研究显示抑制IL-36受体拮抗剂导致的IL-36受体表达抑制，会减少曲霉菌诱导的细胞因子IL-17及IFN-γ的释放。这些数据描述了IL-36依赖性信号是-8- 慢性阻塞性肺疾病合并烟曲霉感染巨噬细胞炎症反应调控机制研究一种新的细胞因子途径，其调节烟曲霉诱导的Th应答，并且显示了TLR4和dectin-1在IL-36γ的诱导中的作用[21]。根据以上的研究发现，我们了解到增进真菌感染诱发的COPD中炎症反应相关的免疫机制的了解将有助于我们攻克真菌诱导型COPD的治疗难题，为临床试验研究提供更多的思路。除了以上提到的纤维胶凝蛋白、白介素等，高迁移率族蛋白（highmobilitygroupbox-1protein，HMGB1）也是一种极具潜力的功能蛋白，HMGB1属于高度保守的非组蛋白染色体结合蛋白，编码属于高迁移率组框架超家族的蛋白质。这种蛋白质在多种细胞过程中起作用，包括炎症，肿瘤细胞迁移和细胞分化。HMGB1能促进宿主对不育和感染信号的炎症反应，并参与先天性和适应性免疫反应的协调和整合。在细胞质中作为用于免疫原性核酸的传感器，涉及TLR9介导的免疫应答的激活，并介导自噬。HMGB1相关的途径是病原体相关DNA胞质传感器并参与质膜启动髓样分化初级应答蛋白88（myeloiddifferentiationfactorprotein88，MyD88）级联反应。作为损伤相关分子模式分子（DamageAssociatedMolecularPatternMolecules，DAMPs），在组织损伤过程中可放大免疫反应，释放到细胞外环境后可以结合DNA，核小体，IL-1β，脂多糖和脂磷壁酸等，并通过多个表面受体的接合活化细胞。作为细胞因子的二硫化物HMGB1（有效分泌）和磺酰基HMGB1（从凋亡细胞释放）可促进免疫耐受性[22-25]。本课题我们拟将开展对HMGB1调节的烟曲霉菌诱导的COPD小鼠肺泡巨噬细胞中炎症反应的相关研究。巨噬细胞在机体固体免疫及获得性免疫中发挥重要作用，研究表明肺部慢性炎症COPD与吞噬细胞吞噬功能缺陷相关[26]。先前COPD上皮完整性的相关研究显示，COPD患者肺泡间隔上皮和内皮细胞死亡增加并且肺组织小气道上皮细胞（airwayepithelialcells，AEC）和淋巴细胞凋亡增加。将导致COPD的相关的许多因素会潜在导致AEC细胞凋亡增加，这些因素包括香烟烟雾，香烟烟雾中的污染物，细胞因子转化生长因子-β（Transforminggrowthfactor-β，TGF-β），IL-8和TNF-α的产出增加，以及嗜中性粒细胞活性和上皮细胞/基质的破坏。此外，除了促凋亡机制增加，吞噬细胞受损可能是导致COPD发病机制的另一个因素，主要表现为患者肺泡巨噬细胞数量明显增加、活性升高。但是其吞噬功能受损会导致炎症性细胞因子异常分泌，组织修复重塑能力受损以及巨噬细胞解毒能力丧失等影响。Toll样受体（Toll-likereceptors，TLRs）、巨噬细胞胶原结构清道夫系统（MacrophageSRwithcollagenousstructure，MARCO）、清道夫受体A1（Scavengerreceptor-A1，SR-A1）、黏蛋白5AC（Mucin5AC，MUC5AC）及水通道蛋白5（Aquaporin5，AQP5）等受体表达的影响会导致巨噬细胞吞噬功能受到抑制，这与COPD的发生及发展密切相关[27-29]。综上，COPD是一种异质性疾病，根据不同分子和细胞途径辨-9- 第二军医大学博士学位论文别疾病表型可为个体化诊断和治疗提供新的方法。目前吸入脂多糖已被用作肺部炎症的模型，细菌蛋白通过TLRs激活巨噬细胞介导的炎症细胞因子的产生和炎症细胞的聚集[30]。来自革兰氏阴性菌的LPS结合TLR4激活NF-κB信号通路，可以诱导包括趋化因子在内的多种参与炎症反应的基因的表达。TLR2主要识别来自革兰氏阳性细菌的成分，如脂磷壁酸和肽聚糖，TLR5结合致病菌如绿脓假单胞菌的鞭毛蛋白[31]。TLR9是一种主要与核内体相关的膜结合受体，它结合特定结构的DNA非甲基化CpG序列，是人类唯一识别细菌或病毒单链DNA的TLR[28]，但是TLR9在肺组织中却不存在，目前因分离的细胞培养TLR9的表达仍存在较多争议[32]。糖皮质激素与TLR配体的组合减少抗炎反应的簇炎因子和趋化因子的分泌，可以增加TLR2表达，从而改善宿主防御。这些分子在COPD相关症状中发挥重要作用，所以进一步的探索基于TLR治疗COPD是必要的。宿主中对吸入颗粒和病原体的先天防御中起作用的另一类受体是由巨噬细胞清道夫受体1基因（Macrophagescavengerreceptor1，MSR1）编码的A类清道夫受体（classAscavengerreceptors，SR-A），与TLR一致，该受体同时也是在巨噬细胞中表达的模式识别受体[33]。SR是Brown和Goldstein在1979年认证的由蛋白质分子构成的大家族，研究最多的是SR-A和S-RB，而肺组织主要表达巨噬细胞胶原结构清道夫系统（macrophagereceptorwithcollagenousstructure，MARCO）和SR-A，其中SR-A在人类中因剪接异构体表达为SR-AI和SR-AII[30]。已有试验报告表明SR-AI和SR-AII是人类COPD和COPD相关表型的候选基因[34]。SR由骨髓细胞及部分内皮细胞表达，是一组结构多样的细胞表面受体，在炎症环境中介导修饰的脂蛋白，凋亡细胞，吸入颗粒和微生物的内吞摄取及清除，是用于多种慢性炎症，肿瘤及心血管疾病的特异性标志物[35]。在先天免疫中，内皮细胞-I（SREC-I）表达的SR在调节TLR的功能中发挥重要作用[36]。基因表达和启动子分析表明核转录相关因子2（transcriptionfactornuclearerythroid–relatedfactor2，Nrf2）作为细胞保护蛋白的关键调控因子，Nrf2可通过直接上调MARCO的转录，从而增强AM的吞噬能力[37]。粘液分泌过多可导致吸烟相关的肺部疾病，特别是对在从小气道中开始的COPD的发病率和死亡率中有重要贡献，但机制尚不完全清楚。糖蛋白的子集粘蛋白（Mucin，MUC）是由呼吸道上皮产生的粘液的主要组成成分，MUC5AC和MUC5B是呼吸道表达最丰富的粘蛋白，其中MUC5AC对肺中病理生理变化最敏感并高度可诱导。先前的研究收集健康不吸烟者和健康吸烟者的小气道上皮细胞，用AffymetrixHG-U1332.0微阵列评估基因表达发现在吸烟者的小气道上皮中MUC5AC表达上调（2.3倍，p<10-8），与吸烟者的小气道上皮中MUC5AC相关的核心基因表达模式的-10- 慢性阻塞性肺疾病合并烟曲霉感染巨噬细胞炎症反应调控机制研究协调上调相关（p<0.01）[38]。粘液主要由水与盐，脂质，蛋白质和糖蛋白组成，不难理解水对MUC的性状及分泌量有重要影响。肺组织的上皮及内皮屏障高度透水并且能表达水通道蛋白（aquaporin，AQP）。在目前已发现的AQP中，在肺泡上皮和粘膜下腺泡细胞表达的AQP5在肺组织为渗透驱动的水运输提供了主要途径，有研究发现AQP表达与MUC分泌之间存在显著负相关关系（r=-0.77，P<0.001），低渗条件下促进MUC分泌并抑制AQP表达[39]，此外，AQP5表达的下调引起MUC的过度产生在另一研究中得到了一致的验证[40]。人类中增加的气道粘蛋白生成相关的基因的鉴定有助于理解气道粘液分泌过多的发病机理，为确立新的治疗目标奠定基础，同时可以改善气道局部渗透浓度并有可能为气道黏液高分泌治疗带来新手段。综上所述，肺泡巨噬细胞能够表达多种细胞表面受体，其对于病原体的识别和吞噬以及对感染刺激的适当免疫应答都有着至关重要的作用。我们拟将开展研究，探讨不同病情的COPD患者气道巨噬细胞吞噬功能的变化及其与受体表达的相关性。-11- 第二军医大学博士学位论文第一部分：慢性阻塞性肺疾病患者巨噬细胞的功能及受体表达的相关性研究一、引言慢性阻塞性肺病在全球范围内具有较高的发病率和死亡率，是以炎症细胞堆积在呼吸道进而导致气流阻塞的呼吸道疾病[41，42]，主要特征为肺功能进行性恶化以及持续性气道炎症[1]。据美国肺协会统计，将近2千万人群被诊断出患有COPD，其死亡率在美国排第三。然而，对于该病的确切分子机制仍然知之甚少。需要引起注意的是，COPD患者经历着不可逆的结构损伤，包括呼吸道重塑及肺泡破坏，最终引起呼吸困难。周期性发作的COPD加重呼吸道症状，并且显著增加死亡风险[43]。研究发现，吸烟是引起COPD的主要因素，然而，尽管在全球范围内鼓励戒烟，吸烟引起的COPD发病率仅仅在发达国家逐渐减少，但在发展中国家却在持续增加。COPD目前缺乏有效的治愈方法，被视为一种不治之症[44，45]。因此迫切需要深入了解慢性阻塞性肺病的病理生理学特征，以便建立有效的治疗方法。以往的研究显示，吸烟的COPD患者即使最后成功戒烟，其气道巨噬细胞的吞噬凋亡细胞方面仍然会存在缺陷[46-50]。如果气道的凋亡细胞不能及时被吞噬细胞清除，那么很可能会导致继发性坏死并进一步促进肺部炎症[51，52]。巨噬细胞是一种重要的免疫细胞，在先天性免疫和获得性免疫中均发挥关键作用。巨噬细胞存在于全身组织，是一类特异性的单核吞噬细胞。若巨噬细胞缺失，将会导致转录因子缺乏，或生长信号减弱，最终导致死亡率增加及发育不良。同时也会因为缺乏巨噬细胞导致血管及神经网络的异常聚集[53]。研究表明，COPD患者的肺泡巨噬细胞及单核细胞源巨噬细胞的吞噬细菌的能力受损后可能会导致细菌的大量繁殖[54]。在COPD中已发现大量的分子具有辅助巨噬细胞吞噬的作用[55]，但它们具体的作用机制仍然不清楚。其中肺泡巨噬细胞是肺免疫反应中关键的细胞。巨噬细胞膜表面的病原体识别受体，能够调整微生物保守模式、病原体相关分子模式及宿主细胞之间的相互作用[56]。巨噬细胞通过膜表面受体识别病原菌，介导内吞和消化等从而发挥吞噬作用。而目前临床研究发现，介导巨噬细胞吞噬作用的受体包括清道夫受体、Toll样受体、补体受体等[57]。呼吸系统炎症在COPD患者的发病进展中扮演着重要的角色。不断发现的证据表明，在COPD患者中Toll样受体与异常刺激引起的免疫应答有关，可能引起慢性炎症反应[58]。TRLs是抗原敏感性模式识别受体的一个亚类，负责先天免疫[59]。在TLR家族中，有10个家族成员活跃于人类疾病。TLR家族通常被分为两个亚组，TLR1，TLR2，TLR4，TLR5，TLR6及TLR11组成第一亚组，主要表达于细胞表面，这些-12- 慢性阻塞性肺疾病合并烟曲霉感染巨噬细胞炎症反应调控机制研究成员的主要功能为识别微生物膜表面成分[59-60]。第二亚组包含TLR3，TLR7，TLR8及TLR9，这类TLR受体表达于细胞内囊泡（如溶酶体、核内体及内质网），并且能够标记微生物核酸[59，60]。作为免疫系统的第一道防线，呼吸道上皮细胞利用大量的受体，包括TLRs以防御抗原及传染性微生物。肺及呼吸道易受病原体及过敏原侵蚀是因为它们通常暴露于吸入的空气中。此外，TLRs能够识别外源性病原体相关的分子模式及宿主源损伤相关的分子模式。TLRs被激活意味着有选择性的引发炎症反应、炎性细胞增殖以及细胞因子释放。在COPD患者中TLR2及TLR4被认为是维持炎症反应主要的受体。然而，改变免疫反应性及TLRs的表达会引起免疫应答损伤[61]。肺泡巨噬细胞表面上的清道夫受体在识别并清除可吸入粉尘及空气中的有害微生物方面发挥重要作用[62]。MARCO已经被证明是肺部细菌的主要受体[63]，对于正常的非特异性宿主防御至关重要[64]。当肺部受感染时，该受体在肝脏及脾脏巨噬细胞中也会表达上调[65-67]，可以结合多种配体，包括脂多糖及脂磷壁酸，同时包括与完整的细菌结合[62,68]。该受体不能发挥其清除功能可能与基因突变相关，进而引起COPD或肺部感染。相关的动物研究实验表明，与正常小鼠相比，MARCO基因敲除小鼠对于肺部吸入性粉尘及臭氧刺激引起的炎症反应有所增加[69]。体内缺乏MARCO小鼠经过气溶胶及卵清蛋白致敏处理后，同样表现出明显的嗜酸性气道炎及气道高反应性，这证实了MARCO在过敏性哮喘中确实发挥着一定的作用[70]。SR-A1主要表达于巨噬细胞当中，但同时也会在树突细胞、内皮细胞、气道上皮细胞及血管平滑肌细胞中表达[71，72]。此外研究表明SR-A1在动脉粥样硬化中也扮演着重要的角色[73]。SR-A1能够结合一系列的配体，诸如氧化低密度脂蛋白、乙酰化低密度脂蛋白、岩藻多糖、硫酸葡聚糖以及自身蛋白[74]，同时能够结合大量保守的微生物结构，如细菌脂多糖及磷脂壁酸[75]。体外研究结果显示，SR-A1可能在先天免疫中发挥重要作用，并且能够增加修饰后脂质的亲和力，提示SR-A1在炎症反应中发挥重要作用[76]。在支气管上皮细胞及肝窦内皮细胞中的研究证实，SR-A1能够有效摄取表面活化蛋白（surfactantproteinDadductedmalondialdehyde-acetaldehydeadduct，SPD-MAA）[77，78]。若缺乏SR-A1这一受体，小鼠支气管上皮细胞将减少IL-8的释放[79]，同时会减少的MAA白蛋白的抗体反应[78]。研究表明，在巨噬细胞中SR-A1也是MAA的主要受体之一[80]。MUC5AC是进化保守的基因，表达气道粘液的主要大分子。基因变异与多种肺病相关，但是MUC5AC在黏膜纤毛清除上发挥独特的作用，对其产生持久的抑制作用。COPD患者的MUC5AC分泌增加，伴随咳痰，是现有的表型定义[81]。粘液层在正常人体中发挥了保护性的作用，通过黏膜纤毛的清除过程帮助清除吸入的外源性物质，包括有毒物质及细菌[82]。黏蛋白MUC5AC和MUC5B是人体气道分泌物中发现-13- 第二军医大学博士学位论文的主要的黏液。然而在呼吸道疾病如COPD中，气道黏液MUC5AC和MUC5B等的增多则加速气道堵塞[83，84]。在体内外研究中发现，辅助T细胞2型细胞因子IL-13影响MUC5AC的基因表达及蛋白合成。而人类原代上皮细胞实验发现，IL-13诱导杯状细胞黏蛋白MUC5AC的表达[85]。已经证实AQP在肺及呼吸道的体液传输中发挥重要作用，而有趣的是，IL-13在支气管上皮细胞的离子传递中也发挥作用。IL-13能够将人类支气管上皮细胞的正常吸收状态转换为分泌状态。持续的炎症反应可能扰乱了上呼吸道上皮细胞的再生。气道上皮细胞原代培养能分化成分泌细胞及纤毛细胞。在研究人类体外鼻粘膜上皮细胞分化的研究中，Skowron-zwarg等比较了CFTR及AQP5这两个通道的表达及定位，在正常情况下，无论IL-13是否存在，这两个通道都定位于完全分化的上皮细胞顶膜。AQP5定位于人类支气管上皮细胞上，并且在纤毛细胞顶端富集[86]。巨噬细胞是肺脏防御系统的重要组成部分，受多种受体表达的影响。本文旨在研究不同病情的COPD患者气道巨噬细胞吞噬功能的变化及其与受体表达的相关性。二、材料与方法（一）材料1.主要仪器及设备表1-1主要仪器及设备仪器名称生产厂家雾化吸入机PARIBOY（德国）生物安全柜ThermoFisherScientific（美国）CO2培养箱ThermoFisherScientific（美国）梯度PCR仪ThermoFisherScientific（美国）流式细胞仪BectonDicknson（美国）荧光定量PCR仪AppliedBiosystems（美国）电泳仪Bio-rad（美国）全自动数码凝胶成像分析系统天能科技（上海）荧光倒置显微镜奥林巴斯（日本）移液枪Eppendorf（德国）-14- 慢性阻塞性肺疾病合并烟曲霉感染巨噬细胞炎症反应调控机制研究2.主要试剂及试剂的配置表1-2主要试剂及试剂的配置试剂名称生产厂家台盼蓝染色液索莱宝生物（上海）二硫苏糖醇纪宁生物科技（上海）TRIzol试剂Invitrogen（美国）氯仿国药集团异丙醇国药集团无水乙醇国药集团西班牙琼脂糖生兴生物（南京）SYBRGreenI百泰克（北京）DEPC水百泰克（北京）0.25%Trypsin-EDTAGibco（美国）小牛血清Gibco（美国）RPMI-1640培养基Hyclone（美国）SuperRTcDNASynthesisKit康为世纪生物（北京）2×UltraSYBRMixture(LowROX)康为世纪生物（北京）细胞培养皿Corning（美国）细胞培养瓶Corning（美国）6孔板Corning（美国）75%乙醇的配制：成分体积（mL）无水乙醇75DECP水25PBS缓冲液配制（pH7.4，1000mL，高压灭菌保存）：成分重量（g）NaCl8.5Na2HPO42.2NaH2PO40.2-15- 第二军医大学博士学位论文1%琼脂糖凝胶：成分体积琼脂糖1gddH2O10mL注：微波炉加热2分钟，随用随配（二）方法1.研究对象选取2014年3月至2015年6月来我院就诊的84例COPD患者，所有患者的纳入标准均符合《慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2013年修订版)》中关于COPD的诊断标准显示：（1）具有慢性咳嗽、咳痰和气短的临床症状及长期吸烟史和（或）有害气体和颗粒接触史；（2）存在持续的气流受限，即肺功能检查，吸入支气管舒张剂后FEV1/FVC<70%；（3）入院时患者处于急性加重期，即患者常伴有短期内咳嗽、咳痰、气短和（或）喘息加重，痰量增多，脓性或黏液脓性痰，可伴有发热等炎症明显加重的表现。本研究中的患者为（1）经过肺功能检查、X线或者CT检查确诊的COPD患者（2）患者的年龄大于等于40岁；（3）选择病情处于稳定期COPD患者；（4）所有纳入患者必须签署知情同意书。排除标准：（1）排除合并有严重的心脏、肾脏、肝脏及血液系统疾病的患者；（2）排除伴随着哮喘、支气管扩张、支气管肺癌、肺结核、肺纤维化或者其它肺部慢性疾病的患者；（3）排除伴有糖尿病、高血压、冠状动脉粥样硬化等慢性疾病；（4）排除近一个月内出现发烧或者其它感染性疾病的患者。根据气流受限严重程度对患者的肺功能进行分级，标准如下：FEV1占预计值%大于等于50%为轻中度，FEV1占预计值%小于50为重度。根据患者病情的严重程度将其分为轻中度组与重度组。其中轻中度组患者具有44例，重度组患者具有40例。另外，选择同期在我院体检的健康人做为对照组。对照组排除呼吸系统疾病、糖尿病等慢性病史，且无心脏、肾脏、肝脏等重要器官的器质性病变，排除体检前2个月内有呼吸系统疾病的发生、并且体格检查和胸部X光片出现异常者。COPD组和对照组都必须签署知情同意书。2.痰液的获取及处理将轻中度COPD组、重度COPD组和对照组均先雾化吸入生理盐水：其中对照组吸入1%-5%，COPD组吸入1%-3%，然后用鼻子使劲吹气，取痰前先清洗口腔，对准预先准备好的无菌干燥的培养皿用力咳痰，取3-4口痰液即可。若以唾液为主，-16- 慢性阻塞性肺疾病合并烟曲霉感染巨噬细胞炎症反应调控机制研究则表示所取标本不符合实验要求，需要重新收集痰液标本。收集的标本不能长时间放置，须在2小时内对其进行处理,若长时间不处理，可对咳痰进行-80℃冷冻处理。从收集的痰液中挑选出粘液部分，置于无菌干燥试管中，用天平对其进行称重，然后加入4倍该体积的二硫苏糖醇（浓度为0.1%），37℃水浴锅中摇匀直至痰液中粘液溶解（约需要25分钟），过滤，去除不溶物，滤液部分1500rpm离心10分钟，取上清液，加入同二硫苏糖醇同等体积的PBS缓冲液，将细胞充分洗涤5分钟，3000rpm常温离心10分钟。将上清液保存到-80℃冰箱中备用，其沉淀进行痰细胞学检查。3.痰细胞染色取离心后试管底部的痰细胞，滴加到预备的载玻片上，进行涂片，自然风干后，使用95%的无水乙醇固定后，使用台盼蓝溶液进行染色，检查细胞活力，此过程中活细胞不能被染上颜色，丧失活性或者细胞膜不完整的细胞则会被染成蓝色。4.痰液巨噬细胞分离和培养采用RosetteSep细胞分离法分离痰液中的巨噬细胞。同步骤3离心后，取试管底部的细胞沉淀中加入体积为1毫升的RPMI-1640培养基（此培养基中含有20%小牛血清）重悬细胞，将细胞平铺到培养皿中放入37℃，5%CO2的细胞培养箱中培养2小时，取出培养皿，弃上清液，向培养皿中加入5毫升恢复至室温的无菌的PBS缓冲液，轻轻晃动培养皿以清洗细胞，去除未贴壁细胞。然后加入含有20%小牛血清的RPMI-1640培养基，置于37℃，5%CO2的细胞培养箱中培养48小时，然后将痰液细胞通过荧光素标记的抗CD68抗体使用流式细胞仪分析巨噬细胞的纯度。发现所培养的细胞几乎全部为巨噬细胞继续用含有20%小牛血清的RPMI-1640培养基培养，每两天换一次培养基。5.巨噬细胞吞噬功能检测将巨噬细胞培养72小时后，用胰酶消化后进行吞噬功能检测，具体步骤如下：首先将生物安全柜使用紫外线消毒30分钟，将紫外灯关闭15分钟后，才能进行细胞实验（防止细菌的光复活现象）。将培养基和高压灭菌后的PBS缓冲液提前放置在37℃水浴锅中，从培养箱中取出培养瓶，弃去培养液，加入PBS缓冲液轻轻清洗培养瓶中的细胞一次，去除死细胞和一些代谢产物，然后加入1毫升胰酶，37℃培养箱中放置5分钟，显微镜下观察细胞是否从壁上全部脱落下来，待细胞从培养瓶的壁上脱落后，加入5毫升含有小牛血清的培养基终止消化作用，然后将细胞用移液枪移入至15毫升离心管中，1000rpm离心室温5分钟，弃上清液，加入培养基的体积至1毫升处，将细胞充分混匀后，使用细胞计数板对细胞进行计数，然后按照-17- 第二军医大学博士学位论文1×106/毫升的密度将细胞接种到6孔板中，37℃，5%CO2培养箱中培养15小时，每个孔中加入1~10×106荧光标记的曲霉孢子，37℃条件下孵育2小时，用PBS缓冲液清洗2次，70%乙醇固定10分钟，避光孵育后用荧光显微镜观察吞噬曲霉孢子的巨噬细胞的比例及吞噬曲霉孢子的个数，吞噬指数（Phagocyticindex,PI）为被吞噬的曲霉孢子总数与巨噬细胞总数的比值。6.相关受体表达的检测按照上述方法将细胞消化后接种到6孔板中，培养48小时后，将6孔板取出至RNA提取操作区域，开始提取细胞的总RNA，操作步骤如下：（1）弃去培养基，用预冷的PBS缓冲液轻轻冲洗细胞一次；（2）加入1毫升Trizol裂解液，用移液枪充分吹打，静置充分裂解细胞5分钟，（3）加入200微升的三氯甲烷，上下颠倒混匀（此步骤中需剧烈震荡）约15秒，然后室温静置5分钟；（4）4℃12000g高速离心15分钟，离心管中出现三层，上层的无色液体为本实验所需，用移液枪将上层无色液体小心吸出，转移至一个新的无酶离心管中（此步骤切不可触动中间的白色絮状层）；（5）向离心管中加入等体积的异丙醇即500微升，上下轻轻颠倒混匀，室温静置10分钟；（6）4℃12000g高速离心10分钟，离心管底部出现了极少量白色沉淀，沉淀即为总RNA；（7）倒掉上清液（此步骤也要轻，切勿将白色沉淀也倒出），加入提前配置好的500微升75%乙醇（DEPC水配置），颠倒离心管，使沉淀漂浮起来，如果上下颠倒不能够使沉淀漂浮，可选择用移液枪轻轻吹打，然后4℃12000g高速离心5分钟；（8）取出离心管，倒掉上清液，重复步骤（7）一次；（9）取出离心管，弃上清液，将离心管倒扣在一张滤纸上10分钟，使乙醇充分挥发掉，以免对实验结果造成影响；（10）加入适当体积的DEPC水（根据沉淀大小加），溶解RNA沉淀；（11）取2微升用核酸测定仪检测总RNA的浓度及纯度，发现A260/A280及A260/A230的值均在所要求的范围内，表明所提取的RNA的纯度较好，且无盐离子残留；（12）配置琼脂糖凝胶，取5微升上样进行凝胶电泳，检测提取的总RNA的完整性，发现有三条带，这表明RNA的完整性相对较好。使用逆转录试剂盒对所提取的总RNA进行逆转录，操作如下：（1）预先将RNA模板及试剂盒中的试剂放置在冰上融化；（2）按照表1-3，配置逆转录的反应体系（20L）；（3）将离心管进行旋涡震荡，将管壁上的溶液离心至管底，使里面的液体混匀；（4）42℃50分钟，然后85℃5分钟使逆转录酶灭活，结束反应后短暂离心，迅速将离心管放置在冰上冷却；（5）如果暂时不进行RealtimePCR操作，将装有cDNA的离心管置于-20℃保存备用。-18- 慢性阻塞性肺疾病合并烟曲霉感染巨噬细胞炎症反应调控机制研究表1-3逆转录的反应体系（20L）试剂剂量dNTPMix4LSuperRTBuffer4LPrimerMix2LRNA模板2gSuperRT1LRNase-FreeWater补足到20L利用RealtimePCR检测目的基因的表达（1）引物设计，序列如下表1所示（引物由南京金思瑞生物科技有限公司合成）；根据引物说明书操作，先将含有粉末状的引物试管12000g离心5分钟，然后加入适量的无菌ddH2O，上下颠倒混匀，分装出一部分进行试验，其余的-20℃冰箱冻存，防止反复冻融；（2）将cDNA、引物和PCR试剂盒中的相关试剂冰上融化；（3）按照表1-4配置PCR反应体系（25L）；（4）将上述体系加入PCR管中后，旋涡震荡混匀，按照表1中的扩增条件，在Real-timePCR仪上对TLR4、MARCO、SR-A1、MUC5AC、AQP5基因进行扩增，检测这几个基因及内参基因-actin的Ct值。结果以相对于β-actin的倍数来表示。表1-4PCR反应体系（25L）试剂体积2×UltraSYBRMixture12.5LcDNA模板2LForwardPrimer1LReversePrimer1LddH2O8.5L表1-5基因的引物序列和Real-timePCR扩增条件基因序列(5'-3')扩增条件TLR4GGATGATGTCTGCCTCGCGCC50℃30min，94℃2min，94℃20s，60℃20s（47cycles），TTAGGAACCACCTCCACGCAGGG68℃20sMARCOFATCCTGCTCACGGCAGGTACT94℃40s，58℃40s，72℃GCACATCTCTAGCATCTGGAGCT2min（28cycles），72℃10minSR-A1TCCTTGCAGAGTCTGAATATGACT50℃30min，94℃2min，94℃-19- 第二军医大学博士学位论文CCTCCTGTTGCTTTGCTGTAGATT20s，60℃20s（47cycles），68℃20sMUC5ACTGTTCTATGAGGGCTGCGTCT94℃3min，94℃20s，57℃20s，72℃20s（35cycles），ATGTCGTGGGACGCACAGA72°C5minAQP5GCGCTCAGCAACAACACAAC94℃40s，58℃40s，72℃GTGTGACCGACAAGCCAATG2min（28cycles），72°C10minβ-actinCTCCATCCTGGCCTCGCTGT94℃2min，58℃40s，72℃2min（30cycles），72°C10min7.数据统计本实验中所涉及到的计量资料用均数±标准差(x±s)表示，两组间差异比较采用t检验，多组间差异比较采用单因素方差分析，并用LSD的方法进行两组间差异的比较。巨噬细胞PI与受体的相关性采用Spearman相关性分析，当P值小于0.05时，表明差异具有统计学意义。三、结果（一）研究对象临床资料本研究中的84例患者中，包括男性58例，女性26例，年龄范围44-70岁，平均年龄为（64.07±8.64）岁；患者的病程范围为5-17年，平均为（11.64±3.76）年；健康对照组包括男性27例，女性13例，年龄范围43-68岁，平均年龄为（63.66±9.02）岁。采用t检验对患者的年龄和性别进行比较，发现COPD组和健康对照组在分别年龄和性别方面均没有统计学意义（P>0.05），具有可比性。（二）巨噬细胞吞噬功能轻中度COPD组、重度COPD组和对照组痰液中细胞总数、巨噬细胞占总细胞的比例及PI的比较见表1-6：与健康对照组相比，轻中度组和重度COPD组的痰液中的细胞总数要明显增多，但是巨噬细胞的比例却明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05）；与轻度组相比，重度组的痰液中细胞总数和巨噬细胞比例均无统计学意义；与健康对照组相比，轻中度组和重度组巨噬细胞的吞噬能力均受到抑制，且重度组巨噬细胞的吞噬能力被抑制的更加明显，差异具有统计学意义（均为P<0.05）。-20- 慢性阻塞性肺疾病合并烟曲霉感染巨噬细胞炎症反应调控机制研究表1-6痰细胞总数、巨噬细胞数目和PI比较GroupsCasesTotalnumberofmacrophage（%）PIcells（×105cell/g）controlgroup405.43±2.1560.73±4.2985.47±9.23mild-moderategroup4415.53±4.03*54.34±6.04*78.41±10.05*severegroup4017.43±5.15*52.09±5.96*72.57±9.34*#F-13.67.446.21P-<0.05<0.05<0.05注：*P＜0.05,comparedwiththecontrolgroup;#P＜0.05,comparedwiththemild-moderategroup.（三）巨噬细胞中受体的表达Real-timePCR检测受体的表达结果如表1-7所示：三组间MARCO和SR-A1表达量无明显变化，差异没有统计学意义。其中与健康对照组相比，轻中度组COPD患者巨噬细胞TLR4的表达无统计学意义，但是重度组COPD患者的巨噬细胞中TLR4受体的表达呈现明显上调，同时，与轻中度组相比，重度组TLR4受体的表达也明显上调，差异具有统计学意义（均为P<0.05）。与健康对照组相比，轻中度和重度COPD患者的巨噬细胞中MUC5AC的表达均明显上调，且与轻中度组相比，重度组的表达量更高（均为P<0.05）。与健康对照组相比，轻中度和重度组AQP5的表达均明显下调，且与轻中度组相比，重度组的表达量更低（均为P<0.05）。表1-7三组间巨噬细胞上受体表达情况GroupsCasesTLR4MARCOSR-A1MUC5ACAQP5controlgroup400.92±0.651660.73±344.16859.45±229.071.65±0.456.89±1.36mild-moderategroup441.14±0.731705.31±326.27778.79±210.795.38±2.04*3.86±0.75*severegroup402.74±1.02*#1642.19±405.16748.57±309.317.64±2.15*#1.79±0.59*#F-9.520.221.8217.2521.76P-＜0.05＞0.05＞0.05＜0.05＜0.05注：*P＜0.05,comparedwiththecontrolgroup;#P＜0.05,comparedwiththemild-moderategroup.-21- 第二军医大学博士学位论文（四）巨噬细胞的吞噬指数PI与受体表达相关性分析用Spearman分析巨噬细胞PI与受体表达相关性，结果显示PI与TLR4和MUC5A表达量呈负相关（r＝－0.52、－0.36，P＜0.05），与AQP5表达量呈正相关（r＝0.41，P＜0.05）。四、讨论巨噬细胞是肺部抵抗外来病原菌和异物的第一道防线，其活性和功能对肺组织功能的维持起着重要作用。巨噬细胞广泛存在于COPD患者的肺泡和气道表面，是患者肺部防御系统中数量最多的免疫细胞，它能够吞噬炎性细胞同时分泌细胞因子启动并调节局部炎症反应。研究显示，COPD患者的巨噬细胞对气道上凋亡的上皮细胞、颗粒物和病原微生物等的吞噬能力下降，进而损伤肺部的天然免疫系统，导致COPD患者病症急速加重[14]。曾东华等[87]采用烟熏法制作COPD大鼠模型，发现大鼠的肺灌洗液中的细胞主要巨噬细胞和中性粒细胞，且巨噬细胞的量要多于中性粒细胞，但是与正常对照组相比，模型组大鼠巨噬细胞所占的比例降低，其吞噬功能也明显下降。Barnawi研究小组发现，COPD患者在体外的杀菌活性明显降低[88]。本研究结果显示，与健康人相比，COPD患者痰液中细胞总数明显增多，但是巨噬细胞所占的比例却明显降低，这与上述文献中所描述的现象相一致，巨噬细胞比例减少可能与其凋亡有紧密联系。Belli等[89]的研究发现香烟烟雾能够诱导COPD患者气道巨噬细胞的凋亡增加，并且凋亡速度与细胞的吞噬功能被抑制的程度具有相关性。本研究中显示，COPD患者巨噬细胞的吞噬能力与健康对照组相比明显受到抑制，且与疾病的严重程度具有相关性，这与之前的研究结果也相一致。本研究进一步证实了COPD患者气道中的巨噬细胞吞噬能力降低，且病情越严重，巨噬细胞的吞噬能力越低。。巨噬细胞经细胞表面的模式识别受体识别病原菌并介导细胞的内吞、消化和呈递等方式发挥吞噬功能。研究显示，许多模式识别受体都能够介导巨噬细胞的吞噬作用，如清道夫受体（SRs）、补体受体和Toll样受体等[57]，具有代表作用的受体有TLR4、SR-A1和MARCO。TLR4受体能够激活信号转导通路，诱导巨噬细胞的杀伤功能并清除病原体。TLR4受体活化后能够诱导其它信号通路的活化，如IRAK4、p38和MyD88通路，从而提高巨噬细胞对革兰氏菌的吞噬能力[90]。VandeGdrde等[91]的研究表明，与健康的对照组相比，COPD患者的肺泡和气道中巨噬细胞的TLR4和TLR2的mRNA水平表达均增加。TLR4受体的配体LPS能够激活巨噬细胞，使其释放金属基质蛋白酶，进而影响COPD的病情进展。本研究结果显示，与对照组相比，轻中度组TLR4受体的表达量无明显差异，但是重度组TLR4受体的表达量明显增加；且与轻中度组相比，也具有统计学意义（P＜0.05）。证实我们的研究结果与相关文献-22- 慢性阻塞性肺疾病合并烟曲霉感染巨噬细胞炎症反应调控机制研究所报道基本相符。我们进一步比较了巨噬细胞的吞噬指数与TLR4受体mRNA表达量的关系，发现这两者之间呈现负相关（r＝－0.52，P＜0.05）。结果提示，重度COPD患者可能通过TLR4受体的激活来介导机体的免疫反应，但是TLR4受体的过度表达又会引起机体持续的炎症反应，导致巨噬细胞的吞噬能力减弱，进一步对机体产生损害作用。但是本研究中，COPD患者与健康对照组中MARCO和SR-A1的表达并没有显著差异，且巨噬细胞的吞噬指数PI与这两者的表达也没有显著的相关性。这表明，清道夫受体在COPD患者中介导巨噬细胞吞噬作用，其发挥的作用并不是特别明显。COPD的病理特征除了包括慢性炎症外，还包括粘膜下腺体增生和粘膜杯状细胞所导致的气道粘液分泌增多。呼吸道粘液中的黏蛋白与水比例失衡会使痰液粘稠，导致感染的发生。有研究报道，气道粘液分泌增多与巨噬细胞的吞噬能力降低具有相关性[92]。MUC5AC是气道粘液中重要的大分子蛋白，其分泌增多是气道炎症反应的必然后果，它的大量分泌又为细菌的繁殖提供了良好的培养基[93]。AQP5是肺组织和气道中重要的水转运通道，其表达下调会导致气道中的水分减少，从而提高黏蛋白浓度[29]。文献显示，COPD患者MUC5AC和AQP5的表达具有负相关性，且二者的表达量的改变与COPD患者的病情相关。但是目前临床上对于MUC5AC和AQP5与巨噬细胞吞噬功能的研究甚少。Metcafe等[94]的研究结果显示，COPD患者TLR4的表达与MUC5AC和AQP5的表达水平具有相关性，推测MUC5AC和AQP5表达水平的变化可能是气道炎症的结果，二者可反过来影响炎症反应进而影响TLR表达的改变，从而对巨噬细胞的吞噬功能产生影响。本研究中巨噬细胞吞噬指数与MUC5AC的表达具有负相关性（r＝－0.36，P＜0.05），与AQP5表达呈现正相关性（r＝0.41，P＜0.05），但是机制还不清楚，仍需进一步探究。总之，本研究结果显示，COPD患者气道巨噬细胞占总细胞的比例明显下调，巨噬细胞的吞噬功能受到抑制，且与疾病的严重程度相关，这可能与TLR4、MUC5AC表达增加及AQP5表达降低等有关。五、本章小结通过比较年龄和性别无差异的COPD患者和健康对照组痰液中细胞数目发现COPD患者痰液中细胞总数明显增多，巨噬细胞所占的比例明显降低，但是两者与患者疾病的严重程度关系并不明显。COPD患者巨噬细胞的吞噬能力明显受到抑制，这与患者的疾病程度呈现正相关性。比较COPD患者和健康对照组痰液中的巨噬细胞中受体的表达情况发现，COPD患者TLR4受体的表达明显增加，而清道夫受体MARCO和SR-A1的表达无明显差异。对比分析巨噬细胞吞噬功能与巨噬细胞受体表达情况发现，吞噬功能与TLR4受体的表达呈负相关。本研究又进一步发现巨噬细-23- 第二军医大学博士学位论文胞的吞噬功能与MUC5AC表达呈负相关而与AQP5的表达呈正相关。总之，本研究结果表明COPD患者中巨噬细胞的吞噬功能受到抑制，可能与TLR4、MUC5AC表达增加及AQP5表达降低等有关。-24- 慢性阻塞性肺疾病合并烟曲霉感染巨噬细胞炎症反应调控机制研究第二部分HMGB1介导烟曲霉孢子引起的COPD小鼠气道巨噬细胞的炎症反应一、引言近年来侵袭性肺曲霉病（invasivepulmonaryaspergillosis，IPA）的发生率和死亡率逐渐上升，该病常见于免疫系统受损人群[95]，研究表明COPD恶化时感染IPA风险显著增加。约一半住院患者COPD加重与呼吸道病毒和/或细菌感染有关[96]。严重COPD患者中IPA的发展是各种综合因素共同影响的结果。首先，在严重COPD患者普遍存在营养消耗，有证据表明晚期COPD患者中的营养不良与增加的死亡率有关。其次，长期吸烟和反复感染使纤毛运动功能受损，减少了肺气道的微生物病原体清除。第三，在COPD急性加重时使用广谱抗生素影响了正常菌群的分布，这可能导致气道中菌群的发展倾向于真菌。最后，广泛使用类固醇激素及广谱抗生素疗的过程中，可能会造成患者肺泡巨噬细胞及中性粒细胞功能受抑以及纤毛运动障碍，使COPD患者极大的增加了感染IPA的可能性[97]。这与COPD恶化时肺中嗜中性粒细胞，巨噬细胞和各种细胞因子等在内的炎症标志物增加的现象相一致。由于IPA缺乏具体的体征和症状，及时诊断极有挑战性，在COPD中的真实发病率可能被低估[98]。曲霉属是我们生活环境中普遍存在的腐生真菌，分生孢子发芽形成的菌丝是造成组织损伤的侵入形式。源自血液单核细胞的肺泡巨噬细胞形成抵抗曲霉菌分生孢子的第一道防线，其抵达肺泡，通过释放如肿瘤坏死因子、巨噬细胞炎症蛋白（macrophageinflammatoryprotein，MIP-1α）细胞因子等。曲霉属抗原诱导Th-1细胞对IFN-γ和IL-12的释放增加，并诱导Th-2细胞反应增加白介素IL-4和IL-10从而杀死分生孢子，提高对感染的保护作用，同时能防止其萌发形成菌丝[99]。几丁质是烟曲霉分生孢子的重要的细胞壁组分，其通过活化Syk激酶和磷脂酰肌醇3-激酶（Sykkinaseandphosphatidylinositol3-kinase，Syk/PI3K）在人免疫球蛋白存在下诱导IL-1受体拮抗剂而诱导抗炎免疫应答，表现出抗炎迹象。HMGB1是高迁移率组蛋白中最有代表性的蛋白家族，属于一种损伤相关分子模式激活炎症的蛋白质。通过在胞吞作用后内质体内部的质膜上发现的模式识别受体，晚期糖基化终产物受体（ReceptorforAdvancedGlycationEnd-product，RAGE），RIG-I样受体（RIG-I-likereceptors，RLRs），NOD1样受体（NOD1-likereceptors，NOD1s）和AIM2样受体（AIM2-likereceptors，AIM2s）激活“炎性小体”来“警告”免疫系统[100]。HMGB1被坏死的细胞和炎症细胞释放到细胞外，作为细胞因子参与许多炎性疾病的发病机制，间接促进核因子-κB（NuclearfactorkappaκB，NFκB）、血管内皮生长因-25- 第二军医大学博士学位论文子（Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）、TNF-α、转化生长因子-β（Transforminggrowthfactor-β，TGF-β）的表达。大量已有的研究发现HMGB1的活化与肺损伤、肺纤维化、肺部癌症等肺部疾病的发展密切关联[101]，严重COPD患者的支气管肺泡灌洗液、上皮细胞和肺泡巨噬细胞以及血浆中的HMGB1的水平都显著高于正常人。曾有研究发现所有受试者和COPD患者的血浆和痰中的HMGB1水平与肺功能参数例如肺功能检查指标中第一秒最大呼气容积FEV1占预计值百分比（FEV1%预计值）和第一秒用力呼气容积占用力肺活量百分比（FEV1/FVC）比率有着显著的负相关性，其中痰HMGB1水平较血浆HMGB1水平与肺功能指数有更强的负相关关系[101]。所以HMGB1很有作为COPD诊断及恶化程度重要标志物的潜力。RAGE高级糖基化最终产物特定的受体（AdvancedGlycosylationEnd-ProductSpecificReceptor，AGER）是首个被发现的HMGB1受体，HMGB1与细胞表面的RAGE结合促使活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）产生和转录因子核因子κB（nuclearfactorκB，NF-κB）活化，随后上调各种白细胞粘附分子，膜受体和促炎细胞因子如IL-1β，IL-6，TNF-α和RAGE[101]。曾有研究显示用抑制剂靶向COPD小鼠因子NF-κB，发现肺组织中HMGB1的下调。香烟烟雾是极其浓缩的ROS和活性氮物质的来源，可以诱导HMGB1水平的升高，激活并释放炎症小体。由于可溶性RAGE（sRAGE）可能抑制HMGB1的活性，它在临床上可能具有治疗一些具有高水平HMGB1的肺部炎症性疾病的潜在价值。全基因组关联研究显示编码RAGE的基因Ager是COPD的易感性基因[101]。此外，HMGB1受体还可以通过与TLRs家族中的几个重要受体TLR2、TLR4、TLR9的相互作用来传递细胞信号，它们属于脯氨酸和羟脯氨酸的细胞壁结构蛋白家族并且直接识别病原体上的病原相关分子。当大多数TLR受到刺激时，与MyD88相互作用可以活化NF-κB并诱导促炎因子的产生。作为TLR信号转导途径中的主要接头蛋白MyD88，通过其C-端的TIR结构域募集IL-1R相关蛋白激酶(IL-1Rassociatedkinase，IRAK)，诱导炎症细胞因子如IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α、干扰素(interferon，IFN)的释放以及粘附分子等的表达。综上所述，Myd88通路在COPD患者慢性气道反应中起重要作用，抑制该信号通路的活化可能对COPD炎症发生发挥抑制作用。还有研究结果表明HMGB1除释放炎症介质外同时可“回收”有害的促炎介质，在诱导和延长炎症过程中发挥重要作用[101]。尽管气道炎症参与COPD的发展，但目前的抗炎治疗在维持COPD联合IPA患者的肺功能和症状方面效率很低，通过观察以往各项研究我们发现HMGB1与受体RAGE、TLR2和TLR4对发生COPD以及COPD恶化感染IPA的过程中的免疫和炎症反应起着十分重要的促进作用。我们假设HMGB1可能介导烟曲霉诱导的COPD疾病的炎症反应，也极有可能成为COPD治疗的潜在靶标。使用香烟烟熏的方法建-26- 慢性阻塞性肺疾病合并烟曲霉感染巨噬细胞炎症反应调控机制研究立COPD大鼠模型，通过HE染色来检测肺组织的病理变化评价模型。在COPD大鼠建模成功基础上将小鼠的肺泡细胞用烟曲霉分生孢子感染，ELISA评估TNF-α、IL-1β、L-6等炎症介质的表达，RealTimePCR和Westernblot测定HMGB1、TLR2、TLR4和Dectin-1的表达。最后通过GraphpadPrism5软件对相关实验结果进行统计分析，研究HMGB1调节烟曲霉菌诱导COPD小鼠肺泡巨噬细胞中的炎症反应。二、材料与方法（一）材料1.主要仪器和设备表2-1主要仪器和设备仪器名称生产厂家酶标仪ThermoFisherScientific（美国）低温高速离心机ThermoFisherScientific（美国）核酸测定仪ThermoFisherScientific（美国）生物安全柜ThermoFisherScientific（美国）CO2培养箱ThermoFisherScientific（美国）组织切片机Leica（德国）烤片机Leica（德国）蛋白电泳和转膜系统Bio-rad（美国）电泳仪Bio-rad（美国）荧光定量PCR仪ABI（美国）微波炉美的（中国）光学显微镜Nikon（日本）-80℃超低温冰箱海尔（中国）PAB-S200被动吸烟动物染毒系统贝兰博科技（北京）电子天平市天量仪器（常熟）组织均浆器中科科尔（北京）全自动数码凝胶成像分析系统天能科技（上海）-27- 第二军医大学博士学位论文2.主要试剂和试剂的配置（1）主要试剂表2-2主要试剂试剂名称生产厂家椰树牌香烟中烟（广东）苏木素盈公试剂（上海）伊红盈公试剂（上海）RIPA裂解液碧云天生物（上海）BCA法蛋白定量试剂盒捷瑞生物（上海）Na2HPO3·12H2O国药集团（上海）氯仿国药集团（上海）无水乙醇国药集团（上海）异丙醇国药集团（上海）甲醇国药集团（上海）KCl国药集团（上海）NaCl国药集团（上海）KH2PO4国药集团（上海）牛血清白蛋白（BSA）索莱宝生物（北京）HRP标记的二抗博奥森生物（北京）SYBRGreenI百泰克生物（北京）DEPC水百泰克生物（北京）SuperRTcDNASynthesisKit康为世纪生物（北京）2×UltraSYBRMixture(LowROX)康为世纪生物（北京）转染试剂Lipofectamine2000Invitrogen（美国）TRIzol试剂Invitrogen（美国）TNF-αELISA试剂盒R&D（美国）IL-1βELISA试剂盒R&D（美国）IL-6ELISA试剂盒R&D（美国）IL-33ELISA试剂盒R&D（美国）TLR2抗体CellSignalingTechnology（美国）TLR4抗体CellSignalingTechnology（美国）MyD88抗体CellSignalingTechnology（美国）-28- 慢性阻塞性肺疾病合并烟曲霉感染巨噬细胞炎症反应调控机制研究p65CellSignalingTechnology（美国）phospho-p65(p-p65)抗体CellSignalingTechnology（美国）IκBα抗体CellSignalingTechnology（美国）syk抗体CellSignalingTechnology（美国）phospho-syk抗体CellSignalingTechnology（美国）PI3Kp85抗体CellSignalingTechnology（美国）β-actinCellSignalingTechnology（美国）RAGE抗体Abcam（美国）Dectin-1抗体Abcam（美国）0.25%Trypsin-EDTAGibco（美国）RPMI-1640培养基Hyclone（美国）PVDF膜millipore（美国）彩虹蛋白MarkerThermoFisherScientific（美国）PMSFSigma（德国）PDTC碧云天生物（上海）R406Selleck（美国）（2）主要试剂的配置10%SDS-PAGE分离胶30%Acr/Bis2.5mL1.5mol/LTris·HCl(pH=8.8)1.9mL10%SDS75μL10%AP75μLTEMD3μLddH2O2.95mL5%浓缩胶30%Acr/Bis416μL1.0mol/LTris·HCl315μL10%SDS25μL10%AP25μL-29- 第二军医大学博士学位论文TEMD2.5μLddH2O1.717mL电泳缓冲液（1000mL）甘氨酸18.77gTris3.03gSDS1g10SDS-PAGE电泳缓冲液（pH8.3）Tris250mMGlycie1.92MSDS0.01%1转膜液（pH8.3）Tris25mMGlycie192mMTBSDS0.01%S甲醇20%缓冲液（1000mL）NaCl8.8g1mol/LTris·HCl(PH=7.5)10mLTBST缓冲液(现用现加)100mLTBS缓冲液99mLTween201mL封闭液TBST缓冲液10mL胎牛血清10μLBSA0.5gPBS缓冲液1000mL-30- 慢性阻塞性肺疾病合并烟曲霉感染巨噬细胞炎症反应调控机制研究NaCl8.5gNa2HPO3·12H2O3.63gKCl0.2gKH2PO40.24g（3）实验动物20只雄性BABL/C小鼠购买于上海斯莱克实验动物有限公司，6-8周龄，饲养于无特定病原体污染（Specificpathogenfree，SPF）级环境条件下，温度25℃左右，给予12小时光明/12小时黑暗，小鼠能够自由取食和饮水，在正式实验开始前，先将小鼠适应饲养一周。（二）方法1.小鼠COPD模型的建立将小鼠随机分成2组：对照组和COPD组，每组10只。将COPD组小鼠置于PAB-S200被动吸烟动物染毒系统的染毒箱内，点燃10根香烟，放入染毒箱内后将其关闭，1小时后取出小鼠，每天一次，持续8周。对照组小鼠使用同样的方法每天置于染毒箱内一次，除吸入新鲜空气外，其它处理条件与COPD组完全一致。2.小鼠支气管肺泡肺灌洗及肺组织的收集第8周时将小鼠先用异丙烷麻醉后，剪开胸部皮肤和胸廓组织，暴露肺组织，并切开颈部，钝性分离软组织后使气管暴露，在甲状腺的位置切开气管，往气管内插入套管并结扎、固定，用注射器吸取1毫升冰冷的PBS缓冲液，通过套管将PBS缓冲液慢慢地注入到双肺中，可见双侧肺部逐渐膨胀，肺部的颜色慢慢变成粉白色，注射完成后，双手轻轻的按摩小鼠肺部，20秒后回抽，此过程重复3次（回抽率达80%以上）。然后将小鼠的右肺剪下固定在10%中性福尔马林液体中。3.HE染色将肺组织放置在福尔马林中固定48小时，进行常规脱水和石蜡包埋，切取4微米厚度的片子，捞片、拷片后进行HE染色，具体操作如下：（1）首先进行二甲苯脱蜡：二甲苯I10分钟，二甲苯II10分钟；（2）乙醇复水：放置再无水乙醇I和无水乙醇II中各5分钟，再放置在95%乙醇I和95%乙醇II中各5分钟，然后再放置到80%乙醇中5分钟，75%乙醇5分钟，最后放置在蒸馏水中5分钟；（3）苏木素染-31- 第二军医大学博士学位论文色液染色8分钟后用自来水流水冲洗3分钟；（4）冲洗好的玻片在1%盐酸酒精中分化15秒，再在装有自来水的容器中反蓝10分钟；（5）伊红染色液染色3分钟后用自来水流水冲洗2分钟；（6）常规脱水：放置在75%乙醇中5分钟，85%乙醇中5分钟，95%乙醇I和95%乙醇II各5分钟，无水乙醇I和无水乙醇II各5分钟；（7）使用二甲苯脱蜡10分钟，共两次；（8）中性树胶封片；（9）通过光学显微镜观察肺组织结构。4.肺灌洗液中细胞分类计数肺灌洗液中的细胞平铺于载玻片上后放置在离心涂片机上，待自然风干且固定后进行HE染色：（1）苏木素染色4分钟后使用自来水清洗1分钟；（2）使用1%盐酸酒精分化15秒，然后再用自来水反蓝5分钟；（3）伊红染色1分钟，自来水清洗1分钟；（4）逐级脱水：75%乙醇放置20秒，85%乙醇放置20秒，95%乙醇I放置95%乙醇II分别放置1分钟，无水乙醇I和无水乙醇II各放置1分钟；（5）透明：二甲苯I和二甲苯II分别静置2分钟；（6）中性树胶封片；（7）根据显微镜下的细胞形态学特征进行分类计数，计数淋巴细胞中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞的个数。5.肺泡巨噬细胞的分离和纯化肺灌洗液经1500rpm离心15分钟，弃上清，在RPMI1640基础培养基上重悬细胞，细胞的浓度调整为1×106/毫升，细胞培养箱中放置2小时，弃去上清中未贴壁的细胞，使用D-Hanks液洗涤2次后再次除去非贴壁细胞，巨噬细胞就是在培养基中贴壁的细胞。6.肺泡巨噬细胞鉴定和培养首先进行巨噬细胞的鉴定，由于CD68时一种主要在巨噬细胞胞浆内表达的特异性抗原，具体方法如下：（1）用4%多聚甲醛将贴壁到盖玻片上的细胞固定10分钟；（2）1%聚乙二醇辛基苯基醚破裂细胞膜；（3）用CD68抗体孵育1小时；（4）FITC标记的荧光二抗孵育45分钟；（5）荧光显微镜下观察。在37℃，5%CO2条件下，将纯化后的巨噬细胞在含有10%小牛血清的RPMI-1640培养基进行培养。7.烟曲霉孢子培养（1）在马铃薯葡萄糖培养基上接种烟曲霉菌株，在37℃培养箱中培养7天；（2）使用细胞刮刀和含有0.1%Tween20的无菌PBS把烟曲霉菌从培养基上轻轻刮洗下来，离心后再用0.1%Tween20清洗两遍；（3）在超净工作台上使用40微米的细胞过滤器进行过滤，即可得到烟曲霉孢子；（4）在倒置显微镜下使用血细胞计数板计数-32- 慢性阻塞性肺疾病合并烟曲霉感染巨噬细胞炎症反应调控机制研究孢子的浓度；（5）无菌条件下用PBS将烟曲霉孢子浓度调整成1×107/毫升，保存在4℃冰箱中备用。8.细胞转染在6孔板中按照1×105个/孔的密度接种巨噬细胞，过夜培养使细胞融合度达到50%左右，使用Lipofcta分钟e2000转染试剂将HMGB1、TLR2、TLR4和Dectin-1siRNA以及对照siRNA（NC-siRNA）转染到巨噬细胞中，具体操作步骤如下：（1）准备转染之前2小时更换新的培养液；（2）轻轻甩动混匀250微升加入100pmolsiRNA的Opti-MEM培养基；（3）用移液枪吸取5微升轻轻混匀的Lipofectamine2000加入到250微升Opti-MEM培养基中，室温中孵育5分钟；（4）将步骤（2）和（3）中的液体混匀后室温放置20分钟；（5）将步骤（4）中的混合物逐滴加入到接种有细胞的6孔板中，37℃培养箱中继续培养；（6）转染6小时后，将培养箱中取出的6孔板弃原来的培养基后加入含有10%小牛血清的RPMI培养基继续培养。9.曲霉孢子处理巨噬细胞按照感染复数（multiplicityofinfection，MOI）为1的比例加入收集的烟曲霉孢子（即每孔加入1×105个孢子）到转染24小时后的巨噬细胞中，37℃，5%CO2，继续培养24小时，用收集的细胞和培养液进行后续检测。10.Real-timePCR检测将巨噬细胞从培养箱中取出至RNA提取操作区域，开始提取细胞的总RNA，操作步骤如下：（1）弃培养基后用冰冷灭菌的PBS缓冲液清洗一次细胞；（2）加入Trizol裂解液1毫升后用移液枪充分吹打，再充分裂解细胞5分钟，（3）加入三氯甲烷200微升，上下颠倒混匀（此步骤需剧烈震荡）约15秒，然后室温下静置5分钟；（4）将离心管放入4℃的低温离心机中12000g高速离心15分钟，此步骤后离心管中会出现三层，上层的无色液体为本实验所需，用200微升移液枪将上层无色液体小心吸出转移至一个新的离心管中（此步骤切不可触动中间的白色絮状层）；（5）向离心管中加入500微升的异丙醇，上下轻轻颠倒混匀，放置室温10分钟；（6）将离心管转入4℃的低温高速离心机中12000g高速离心10分钟沉淀总RNA，离心管底部出现白色沉淀；（7）倒掉上清液（此步骤也要轻，切勿将白色沉淀也倒出），加入提前配置好的500毫升75%乙醇，颠倒离心管，使沉淀漂浮起来，如果上下颠倒不能够使沉淀漂浮，可选择用移液枪轻轻吹打，将离心管放入4℃低温高速离心机中12000g高速离心5分钟；（8）弃上清液，重复步骤（7）一次；（9）取出离心管，弃上清液，将离心管倒扣在一张滤纸上10分钟，使乙醇充分挥发掉，以免对实验结果造成影响；-33- 第二军医大学博士学位论文（10）加入适当体积的DEPC水，溶解RNA沉淀；（11）取2微升RNA用核酸测定仪检测总RNA的浓度及纯度，经检测，A260/A280及A260/A230的值均在所要求的范围内，表明所提取的RNA的纯度较好，且无盐离子残留；（12）配置琼脂糖凝胶，电泳检测总RNA的完整性。所提取的总RNA逆转录使用逆转录试剂盒，操作如下：（1）在冰上融化RNA模板及试剂盒中的试剂；（2）按照下表2-3，配置逆转录的反应体系（20μL）；（3）将离心管进行旋涡震荡，将管壁上的溶液离心至管底，使里面的液体混匀；（4）42℃条件下孵育50分钟，然后85℃孵育5分钟使逆转录酶灭活，结束反应后短暂离心，然后将离心管放置在冰上冷却；（5）如果暂时不进行Real-timePCR操作，将离心管置于-20℃保存。Real-timePCR检测目的基因的表达。设计引物，序列如下表2-5所示，由南京金思瑞生物科技有限公司合成引物；将cDNA、引物和PCR试剂盒中的相关试剂冰上融化；按照列表2-4体系配置PCR反应体系；将上述体系加入PCR管中后，旋涡震荡混匀，按照扩增条件，在PCR仪上对目的基因进行扩增。表2-3逆转录的反应体系（20μL）试剂剂量dNTPMix4μLSuperRTBuffer4μLPrimerMix2μLRNA模板2μgSuperRT1μLRNase-FreeWater补足到20μL表2-4PCR反应体系（25μL）试剂体积2×UltraSYBRMixture12.5μLcDNA模板2μLForwardPrimer1μLReversePrimer1μLddH2O8.5μL-34- 慢性阻塞性肺疾病合并烟曲霉感染巨噬细胞炎症反应调控机制研究表2-5引物序列基因序列(5'-3')HMGB1GCCCCAAAATCAAAGGCGAGTAGGGCTGCTTGTCATCTGCRAGEAGTCCAACTACCGAGTCCGATAGGATGGGTGGTTCCTCCTTTLR2CGTTGTTCCCTGTGTTGCTGCAGAGCTGGCGTCTCCATAGTLR4CTCTGGGGAGGCACATCTTCAGGTCCAAGTTGCCGTTTCTDectin-1TGGGTGCCCTAGCATTTTGGTGATTCTGTGGGCTTGTGGTTNF-αAAGAGGCACTCCCCCAAAAGCCACTTGGTGGTTTGTGAGTGIL-1βGGATGAGGACATGAGCACCTAGGCCACAGGTATTTTGTCGIL-6GAGGATACCACTCCCAACAGACCAAGTGCATCATCGTTGTTCATACAIL-33ATGAGACCTAGAATGAAGTATTCCATTAGATTTTCGAGAGCTTAAACATAβ-actinTCCTCCTGAGCGCAAGTACTCTGCTCAGTAACAGTCCGCCTAGAA11.Westernblot检测（1）细胞中提取总蛋白感染烟曲霉孢子的细胞培养24小时后，从细胞培养箱中取出6孔板，放置在实验台；用移液枪将6孔板中的上清液吸出来，每孔沿侧壁缓缓加入1毫升灭菌后冰冷的PBS缓冲液，轻轻晃动6孔板，清洗细胞；用移液器将6孔板中的PBS吸出，加入200微升含有1mMPMSF的RIPA裂解液，用1毫升移液器的枪头刮贴壁的细胞，充分吹打混匀全部脱落后的细胞，放置冰上30分钟；将6孔板中的内容物吸入到离心管中，4℃低温高速离心机12000g离心15分钟；小心将上清液转移分装到新-35- 第二军医大学博士学位论文的离心管中，防止反复冻融造成蛋白质降解。（2）蛋白质浓度测定使用BCA法检测提取蛋白的浓度，检测原理如下：蛋白质和BCA结合时，蛋白质可将BCA工作液中的二价铜离子转化成一价铜离子，一价铜离子可以将两分子的BCA螯合，并形成紫色复合物。紫色复合物具有良好的水溶性，在562纳米波长处具有较强的吸光性，因为吸光度与蛋白质的浓度成正比，因此根据吸光度的值可以推算出所检测的蛋白质的浓度。检测方法：准备好试管，BCA工作液按照50:1的比例将A液和B液混匀进行配置；90微升PBS缓冲液加入到10微升标准品中，配置0.5毫克/毫升浓度的标准品；把稀释过的标准品加入到96孔板中，每孔对用的体积分别为0微升、1微升、2微升、4微升、8微升、12微升、16微升、20微升，用PBS缓冲液将每孔的体积补足至20微升；适宜体积的样品加入到96孔板相应的位置，为检测最佳稀释比例，将样品按照1:1，1:5，1:10的比例稀释，，然后用PBS缓冲液补足至20微升；加入200微升BCA工作液到含有标准品和样品的孔中，在37℃的温度条件下静置30分钟；然后再室温条件下冷却5分钟，在562纳米波长处通过酶标仪检测各孔的吸光度值，对照根据标准曲线计算蛋白的浓度。（3）蛋白质的Westernblot检测向每个试管中加入50微克蛋白所检测的蛋白质，再加入蛋白上样缓冲液稀释到20微升；将上述步骤中的混合物充分混匀，在沸水中煮沸5分钟，然后用镊子将试管取出，立即冰上冷却，使用微量离心机短暂离心；配置SDS-PAGE浓缩胶和分离胶，将其倒入胶板中，下层为分离胶，上层为浓缩胶，待两种胶均凝固后，煮沸的蛋白质全部加入上样孔管中，剩一个点彩虹Marker的孔，每个样品需重复三次；使用80伏的电压对蛋白进行浓缩胶的电泳；蛋白上样缓冲液中含有呈蓝色的溴酚蓝，待蓝色越过浓缩胶和分离胶的分界线后，调电压至100伏，进行分离胶的分离；待蓝色条带电泳至分离胶的底部，停止电泳；将胶从胶板中拆下后，去除浓缩胶，在摇床上用蒸馏水清洗胶10分钟；剪下适当大小的PVDF膜并使用甲醇激活2分钟，阳极转移缓冲液中放置激活后的PVDF膜和3张滤纸并浸泡15分钟；在阴极转移缓冲液中放置胶和另外3张滤纸也浸泡15分钟；将胶、滤纸和PVDF膜按照如下顺序摆放在干转移电泳槽上：阳极、阳极转移缓冲液中浸泡的3张滤纸、PVDF膜、阴极转移缓冲液中浸泡的3张滤纸、阴极，这一步骤中一定要彻底赶走滤纸中的气泡，不然很容易引起短路；使用恒流进行转膜：根据蛋白质的分子量使用41毫安转膜相应的时间；使用镊子小心取下PVDF膜（不要用手触碰）将其放入TBS缓冲液中摇床上震荡，-36- 慢性阻塞性肺疾病合并烟曲霉感染巨噬细胞炎症反应调控机制研究清洗10分钟；加入提前配置好的封闭液，室温条件下放置2小时（此过程在摇床上放置）；加入一抗，4℃过夜孵育；加入TBST缓冲液，在摇床上冲洗3遍，分别冲洗10分钟；加入二抗后室温孵育45分钟至1小时；再次加入TBST缓冲液，在摇床上冲洗3遍，分别冲洗10分钟；将ECL发光液加入到PVDF膜上；观察蛋白条带，拍照后使用ImagPro软件计算条带的净光密度；以β-actin为内参，计算目的蛋白与其的比值。12.ELISA本研究ELISA试剂盒检测原理如下：本研究中所检测的IL-33、IL-1β、IL-6和TNF-α都是分泌蛋白，故要在细胞培养液中检测这些蛋白的含量。固相载体表面所结合的抗原或抗体依然是具有免疫学活性的，酶标记的抗原或抗体仍然保留了其本身的免疫学活性，同时也保留着酶的活性。检测时，被检测样本中的抗原或者抗体与固相载体表面的抗体或者抗原发生反应。然后通过洗涤的方式将检测样本中的其他物质与固相载体上的抗原抗体复合物分离开。再加入用酶标记的抗原或者抗体，通过再次反应结合到固相载体上。检测样本中被检测的物质的含量和固相载体上的酶含量呈现一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成有颜色的物质，被检测样本中被检测的物质的含量和该物质的含量有直接的相关性，所以可以根据颜色的深浅进行定量分析。以TNF-α为例，具体的操作步骤如下：（1）将细胞的上清液收集在无菌的离心管中，高速离心机3000rpm离心20分钟，除去细胞碎片；（2）将离心后的上清液分装到若干个无菌离心管中，这样可以避免后续检测时反复冻融导致蛋白质降解从而造成的实验误差；（3）首先要进行预实验，检测样本的最佳稀释比例，即使用样品稀释液将检测样本按照1:1,1:5,1:10的比例稀释至80微升；（4）检测前，从4℃冰箱将试剂盒中所有的试剂拿出，放置在室温30分钟，使试剂恢复到室温；（5）取出酶标板（这里使用几个就取出几个，不要全部取出），按照说明书操作，将稀释的标准品（50微升）依次加入到空白微孔中；（6）向其它空白微孔中加入稀释好的50微升样品，留一个孔做空白对照孔，加入50微升蒸馏水；（7）在除空白对照孔外的所有孔中分别加入10微升的生物素；（8）向各个空中（不含空白对照孔）加入100微升酶标记溶液；（9）37℃条件下用封口胶将酶标板密封孵育1个小时；（10）孵育过程中，将浓缩洗涤液按照1:100的比例稀释成工作液；（11）去除孵育好的酶标板的封口胶，然后在每个孔中加入200微升的洗涤液，分别充分洗涤3次；（12）洗涤以后在吸水纸上将酶标板充分拍干；（13）除空白孔外，各孔中分别加入50微升显色液A和B；（14）将酶标板避光室温放置15分钟；（15）向个空中加入50微升终止液，使反应终止；（16）至于酶标仪中的酶标板，在450纳米波长处测定吸光度值；（17）横坐标-37- 第二军医大学博士学位论文为标准品的浓度，纵坐标为吸光度值，绘制标准曲线；（18）对照标准曲线，根据样本的吸光度值计算样本的浓度。13.抑制剂处理巨噬细胞为了验证HMGB1的作用途径，使用PDTC（NF-κB的抑制剂）和R406（syk的抑制剂）具体操作如下：（1）6孔板中接种巨噬细胞，放置在细胞培养箱中过夜培养后，分别加入2.5μMR406或100nMPDTC后放置在细胞培养箱中继续培养22小时；（2）准备转染HMGB1siRNA之前2小时更换新的培养液；（3）在250微升Opti-MEM培养基中加入100pmolsiRNA，轻轻甩动混匀；（4）用移液枪吸取5微升提前轻轻混匀的Lipofectamine2000加入到250微升Opti-MEM培养基中，然后室温孵育5分钟；（5）把步骤（3）和（4）中的液体轻轻混匀，在室温下放置20分钟；（6）将步骤（5）中的混合物逐滴加入到接种有细胞的6孔板中，37℃培养箱中继续培养；（7）转染6小时后，将6孔板从培养箱中取出，倒去原来的培养基，加入RPMI培养基（含有10%小牛血清）继续培养。（8）转染24小时后，每孔加入1×105个烟曲霉孢子，37℃，5%CO2条件下继续培养24小时，进行后续检测。14.统计学分析用均数±标准差来表示所有的计量资料，使用t检验来表示两组间差异的比较，采用单因素方差分析用于多组间差异的比较，两组间的差异进行比较使用LSD。P<0.05表明差异具有统计学意义。三、结果（一）COPD小鼠模型成功建立用被动吸烟的方法建立小鼠COPD模型后，处死小鼠，检测肺灌洗液中细胞总数、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞的个数。结果如图2-1所示：相比于正常对照组相，COPD组中总细胞数目、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞的个数都有明显增加。-38- 慢性阻塞性肺疾病合并烟曲霉感染巨噬细胞炎症反应调控机制研究图2-1小鼠肺灌洗液中细胞总数及巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的个数。与对照组相比，***P<0.001我们对小鼠的肺组织进行了HE染色，染色结果见图2-2A。从图2-2A中可以看出，对照组的小鼠有完整结构的肺组织，未发现肺泡管壁有增厚现象，未发现有炎症细胞浸润现象，未发现炎性分泌物从管腔内液渗出，肺泡腔结构正常，没有病理性扩大现象；但是COPD小鼠的肺泡结构紊乱，明显的炎性细胞浸润存在于支气管周围。我们又用ELISA检测了肺灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-33蛋白的表达，发现相对于正常对照组小鼠，COPD小鼠肺灌洗液中这四者的表达有较明显增加，差异具有统计学意义（P均<0.05，图2-2B-2E）。图2-2小鼠肺组织HE染色及肺泡灌洗液中细胞因子的表达情况。A：小鼠肺组织HE染色，Control：对照组小鼠，CS为吸烟诱导的COPD小鼠；B-E：小鼠肺灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-33蛋白的表达情况。与对照组相比，***P<0.001。-39- 第二军医大学博士学位论文（二）COPD小鼠巨噬细胞中HMGB1的表达升高CD68主要在巨噬细胞的胞浆中表达，从肺灌洗液中分离纯化巨噬细胞后，我们通过CD68标记对巨噬细胞的特异性进行了检测。结果如图2-3A所示，贴壁的细胞胞浆中呈现红色荧光，这表明收集的细胞是巨噬细胞。如图2-3B所示就是Real-timePCR检测巨噬细胞中HMGB1的表达，相较于对照组，HMGB1mRNA水平在COPD组中表达明显增加，差异具有统计学意义（P<0.05）；Westernblot检测HMGB1蛋白水平表达，发现正常对照组中的巨噬细胞HMGB1蛋白水平表达要低于COPD组（见图2-3C），差异具有统计学意义（P<0.05）。图2-3小鼠巨噬细胞中HMGB1的表达情况。A：CD68免疫荧光染色图；B：HMGB1在培养的细胞中mRNA水平的表达情况；C：Westernblot检测培养的原代巨噬细胞中HMGB1蛋白水平的表达。与对照组相比，**P<0.05，***P<0.001。（三）HMGB1在烟曲霉孢子感染的COPD小鼠巨噬细胞中表达增加前面我们实验发现HMGB1在COPD小鼠巨噬细胞中的表达明显增加，那么它在烟曲霉孢子感染的小鼠肺泡巨噬细胞中的表达情况又是怎么样的呢？我们使用Real-timePCR和Westernblot的方法检测了HMGB1在细胞中mRNA和蛋白水平的表达情况。结果如图2-4所示：相比于未感染烟曲霉孢子的COPD巨噬细胞，感染了烟曲霉孢子的COPD巨噬细胞的HMGB1mRNA和蛋白水平的表达明显增加，相比于感染了烟曲霉孢子的对照组巨噬细胞，它的表达也明显增加，差异具有统计学意义（P均<0.05）。-40- 慢性阻塞性肺疾病合并烟曲霉感染巨噬细胞炎症反应调控机制研究图2-4烟曲霉孢子感染巨噬细胞后HMGB1的表达上调。A：烟曲霉孢子感染24小时后，Real-timePCR检测细胞中HMGB1mRNA水平的表达；B：Westernblot检测烟曲霉孢子感染的原代巨噬细胞中HMGB1蛋白水平的表达。Control组：未感染的正常小鼠巨噬细胞；COPD组：未感染的COPD小鼠巨噬细胞；Control+AF组：烟曲霉孢子感染的正常小鼠巨噬细胞；COPD+AF组：烟曲霉孢子感染的COPD小鼠巨噬细胞。*P<0.05，***P<0.001表示具有差异统计学意义。（四）HMGB1siRNA下调HMGB1的表达在COPD巨噬细胞中通过脂质体转染HMGB1siRNA24小时后，再加入烟曲霉孢子进行感染24小时，Westernblot检测HMGB1蛋白的表达如图2-5所示。相比于COPD+AF组，controlsiRNA组中HMGB1的表达无明显变化，差异无统计学意义；相比于COPD+AF组，HMGB1siRNA组中HMGB1的表达明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。这说明通过脂质体转染的方法能够明显降低HMGB1的表达。-41- 第二军医大学博士学位论文图2-5HMGB1siRNA能够明显下调HMGB1蛋白的表达。COPD+AF组：烟曲霉孢子感染的COPD小鼠巨噬细胞；ControlsiRNA组：烟曲霉孢子感染的COPD小鼠巨噬细胞中转染ControlsiRNA；HMGB1siRNA组：烟曲霉孢子感染的COPD小鼠巨噬细胞中转染HMGB1siRNA。与COPD+AF组相比，***P<0.001。（五）下调HMGB1能够减弱烟曲霉孢子诱导的炎症反应通过转染HMGB1siRNA下调HMGB1的表达，再加入烟曲霉孢子感染细胞，提取细胞的总RNA，检测烟曲霉孢子诱导的炎性细胞因子mRNA水平的表达如图2-6所示。与Control组细胞相比，COPD组细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-33mRNA水平表达明显升高，差异具有统计学意义（P均<0.05）；与Control+AF组和COPD组相比，COPD+AF组中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-33mRNA水平表达均明显升高，差异具有统计学意义（P均<0.05）；与COPD+AF组相比，HMGB1siRNA组中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-33mRNA水平表达明显降低，差异具有统计学意义（P均<0.05），但是ControlsiRNA组中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-33mRNA水平表达无明显变化，差异无统计学意义（P均>0.05）。-42- 慢性阻塞性肺疾病合并烟曲霉感染巨噬细胞炎症反应调控机制研究图2-6HMGB1siRNA能够降低烟曲霉孢子诱导的炎性细胞因子mRNA水平的表达。将巨噬细胞经过特定的处理之后，提取细胞的总RNA检测各组细胞中TNF-α（A）、IL-1β（B）、IL-6（C）和IL-33（D）mRNA水平表达。Control组：未感染的正常小鼠巨噬细胞；COPD组：未感染的COPD小鼠巨噬细胞；Control+AF组：烟曲霉孢子感染的正常小鼠巨噬细胞；COPD+AF组：烟曲霉孢子感染的COPD小鼠巨噬细胞；ControlsiRNA组：烟曲霉孢子感染的COPD小鼠巨噬细胞中转染ControlsiRNA；HMGB1siRNA组：烟曲霉孢子感染的COPD小鼠巨噬细胞中转染HMGB1siRNA。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001表示具有差异统计学意义。转染HMGB1siRNA下调HMGB1的表达，我们收集用烟曲霉孢子感染巨噬细胞的上清液并，检测TNF-α、IL-1β、IL-6和Control组细胞，COPD组细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-33细胞因子水平表达明IL-33等炎性因子，结果见图2-7。相比于显升高，差异具有统计学意义（P均<0.05）；与Control+AF组和COPD组相比，COPD+AF组中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-33蛋白水平表达均明显升高，差异具有统计学意义（P均<0.05）；与COPD+AF组相比，HMGB1siRNA组中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-33表达明显降低，差异具有统计学意义（P均<0.05），但是ControlsiRNA组中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-33表达无明显变化，差异无统计学意义（P均>0.05）。-43- 第二军医大学博士学位论文图2-7HMGB1siRNA能够降低烟曲霉孢子诱导的炎性细胞因子水平的表达。将巨噬细胞经过特定的处理之后，收集细胞培养液，离心去除细胞碎片取上清液检测各组细胞中TNF-α（A）、IL-1β（B）、IL-6（C）和IL-33（D）细胞因子水平表达。Control组：未感染的正常小鼠巨噬细胞；COPD组：未感染的COPD小鼠巨噬细胞；Control+AF组：烟曲霉孢子感染的正常小鼠巨噬细胞；COPD+AF组：烟曲霉孢子感染的COPD小鼠巨噬细胞；ControlsiRNA组：烟曲霉孢子感染的COPD小鼠巨噬细胞中转染ControlsiRNA；HMGB1siRNA组：烟曲霉孢子感染的COPD小鼠巨噬细胞中转染HMGB1siRNA。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001表示具有差异统计学意义。（六）HMGB1能够诱导的炎症反应与Dctin-1和TLR2/4相关为了研究HMGB1诱导的炎症反应与哪些受体相关，我们检测了RAGE、TLR2/4和Dectin-1mRNA水平的表达，结果如图2-8所示。相比于Control组细胞，COPD组中细胞RAGEmRNA水平表达明显增高，且具有统计学差异（P<0.05）；相比于Control+AF组和COPD组，COPD+AF组中RAGEmRNA的表达水平均明显增高，具有统计学差异（P均<0.05）；相比于COPD+AF组，ControlsiRNA组和HMGB1siRNA组中RAGEmRNA水平表达均没有明显变化，无统计学差异（P均>0.05）。相比于Control组，COPD组TLR2、TLR4和Dectin-1mRNA水平表达明显增高，具有统计学差异（P均<0.05）；相比于Control+AF组和COPD组，COPD+AF组中TLR2、TLR4和Dectin-1mRNA水平表达均明显升高，具有统计学差异（P均<0.05）；相比于-44- 慢性阻塞性肺疾病合并烟曲霉感染巨噬细胞炎症反应调控机制研究COPD+AF组，HMGB1siRNA组中TLR2、TLR4和Dectin-1mRNA水平表达明显降低，差异具有统计学意义（P均<0.05），但是ControlsiRNA组中TLR2、TLR4和Dectin-1mRNA水平表达无明显变化，差异无统计学意义（P均>0.05）。图2-8HMGB1siRNA对RAGE、TLR2/4和Dectin-1mRNA水平的表达的影响。巨噬细胞经过特定的处理之后，收集细胞培养液，离心去除细胞碎片取上清液检测各组细胞中RAGE（A）、TLR2（B）、TLR4（C）和Dectin-1（D）mRNA水平表达。Control组：未感染的正常小鼠巨噬细胞；COPD组：未感染的COPD小鼠巨噬细胞；Control+AF组：烟曲霉孢子感染的正常小鼠巨噬细胞；COPD+AF组：烟曲霉孢子感染的COPD小鼠巨噬细胞；ControlsiRNA组：烟曲霉孢子感染的COPD小鼠巨噬细胞中转染ControlsiRNA；HMGB1siRNA组：烟曲霉孢子感染的COPD小鼠巨噬细胞中转染HMGB1siRNA。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001表示具有差异统计学意义。我们又进一步检测了RAGE、TLR2/4和Dectin-1蛋白水平的表达，结果见图2-9。从图中可以看出，COPD组RAGE蛋白水平表达较Control组明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05）；COPD+AF组中RAGE蛋白水平表达较Control+AF组和COPD组均明显升高，差异具有统计学意义（P均<0.05）；ControlsiRNA和HMGB1siRNA组中RAGE蛋白水平表达较COPD+AF组均没有明显变化，差异无统计学意义（P-45- 第二军医大学博士学位论文均>0.05）。COPD组TLR2、TLR4和Dectin-1蛋白水平表达较Control组明显升高，差异具有统计学意义（P均<0.05）；与Control+AF组和COPD组相比，COPD+AF组中TLR2、TLR4和Dectin-1蛋白水平表达均明显升高，差异具有统计学意义（P均<0.05）；与COPD+AF组相比，HMGB1siRNA组中TLR2、TLR4和Dectin-1蛋白水平表达明显降低，具有统计学差异（P均<0.05），但是ControlsiRNA组中的TLR2、TLR4和Dectin-1蛋白水平表达均无明显变化，差异无统计学意义（P均>0.05）。从图中可以发现RAGE、TLR2、TLR4和Dectin-1蛋白水平表达与mRNA表达结果相一致（见图2-8和图2-9）。图2-9HMGB1siRNA对RAGE、TLR2/4和Dectin-1蛋白水平的表达的影响。Control组：未感染的正常小鼠巨噬细胞；COPD组：未感染的COPD小鼠巨噬细胞；Control+AF组：烟曲霉孢子感染的正常小鼠巨噬细胞；COPD+AF组：烟曲霉孢子感染的COPD小鼠巨噬细胞；ControlsiRNA组：烟曲霉孢子感染的COPD小鼠巨噬细胞中转染ControlsiRNA；HMGB1siRNA组：烟曲霉孢子感染的COPD小鼠巨噬细胞中转染HMGB1siRNA。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001表示具有差异统计学意义。利用TLR2/4和Dectin-1siRNA进一步验证了HMGB1是否是通过TLR2/4和Dectin-1受体诱导的炎症反应。COPD小鼠巨噬细胞用脂质体转染TLR2、TLR4和Dectin-1siRNA24小时后再用烟曲霉孢子感染细胞24小时，离心收集细胞培养液，检测上清液中TNF-α（A）、IL-1β（B）、IL-6（C）和IL-33（D）细胞因子的表达情况。结果如图2-10所示，与ControlsiRNA组相比，TLR2、TLR4和Dectin-1siRNA组中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-33细胞因子表达水平均明显降低，差异具有统计学意义（P均<0.05）。-46- 慢性阻塞性肺疾病合并烟曲霉感染巨噬细胞炎症反应调控机制研究图2-10下调TLR2、TLR4和Dectin-1能够下调COPD小鼠巨噬细胞中细胞因子表达。首先转染siRNA分别干扰TLR2、TLR4和Dectin-1的表达，然后用烟曲霉孢子感染细胞24小时后，收集细胞上清液检测其TNF-α（A）、IL-1β（B）、IL-6（C）和IL-33（D）炎性因子的表达。ControlsiRNA组：烟曲霉孢子感染的COPD小鼠巨噬细胞中转染ControlsiRNA；TLR2siRNA组：烟曲霉孢子感染的COPD小鼠巨噬细胞中转染TLR2siRNA；TLR4siRNA组：烟曲霉孢子感染的COPD小鼠巨噬细胞中转染TLR4siRNA；Dectin-1siRNA组：烟曲霉孢子感染的COPD小鼠巨噬细胞中转染Dectin-1siRNA。与ControlsiRNA组相比，**P<0.01，***P<0.001表示具有差异统计学意义。（七）HMGB1siRNA对COPD小鼠巨噬细胞MyD88/NF-κB信号通路的影响研究显示MyD88/NF-κB信号通路在炎症反应中具有重要作用，因此我们进一步探究HMGB1siRNA对该信号通路的影响。图2-11是Westernblot检测提取的细胞总蛋白中MyD88、p65、p-p65和IκB蛋白的表达结果：与Control+AF组相比，COPD+AF组中MyD88和p-P65的表达水平明显增加，IκB蛋白的表达量明显降低，具有统计学差异（P均<0.05）；与COPD+AF组相比，HMGB1siRNA组中MyD88和p-p65-47- 第二军医大学博士学位论文的表达水平明显降低，但是ControlsiRNA组中MyD88和p-P65的表达水平无明显变化，差异无统计学意义（P均>0.05）。检测各组发现，p65的表达量在各组中均没有明显变化，无统计学差异（P均>0.05）。这一结果表明NF-κB总蛋白水平表达无明显变化，但是磷酸化水平明显增加了。COPD小鼠感染烟曲霉孢子的巨噬细胞中MyD88/NF-κB信号通路的活化明显增强，但是下调HMGB1能够降低MyD88/NF-κB信号通路的活化。图2-11下调HMGB1对MyD88/NF-κB信号通路的影响。Control+AF组：烟曲霉孢子感染的正常小鼠巨噬细胞；COPD+AF组：烟曲霉孢子感染的COPD小鼠巨噬细胞；ControlsiRNA组：烟曲霉孢子感染的COPD小鼠巨噬细胞中转染ControlsiRNA；HMGB1siRNA：烟曲霉孢子感染的COPD小鼠巨噬细胞中转染HMGB1siRNA。***P<0.001表示具有差异统计学意义。（八）HMGB1siRNA对巨噬细胞syk/PI3K信号通路的影响通过下调HMGB1后，p-syk、syk和PI3K的表达可进一步确定HMGB1对syk/PI3K信号通路的影响。检测结果如图2-12所示：COPD+AF组中p-syk和PI3K（p85）的表达水平较Control+AF组明显增加，具有统计学差异（P均<0.05）；与COPD+AF组相比，HMGB1siRNA组中p-syk和PI3K（p85）的表达明显降低，但是ControlsiRNA组中p-syk和PI3K（p85）的表达水平无明显变化，差异无统计学意义（P均>0.05）。各组中检测syk表达发现，其表达量在各组中均无明显变化，无统计学差异（P均>0.05）。这些结果显示下调HMGB1的表达能够抑制syk/PI3K信号通路的活化。-48- 慢性阻塞性肺疾病合并烟曲霉感染巨噬细胞炎症反应调控机制研究图2-12下调HMGB1对COPD小鼠巨噬细胞syk/PI3K信号通路的影响。Control+AF组：烟曲霉孢子感染的正常小鼠巨噬细胞；COPD+AF组：烟曲霉孢子感染的COPD小鼠巨噬细胞；ControlsiRNA组：烟曲霉孢子感染的COPD小鼠巨噬细胞中转染ControlsiRNA；HMGB1siRNA组：烟曲霉孢子感染的COPD小鼠巨噬细胞中转染HMGB1siRNA。***P<0.001表示具有差异统计学意义。（九）HMGB1通过MyD88/NF-κB和syk/PI3K信号通路诱导炎症反应我们利用MyD88/NF-κB和syk/PI3K信号通路抑制剂PDTC和R406预处理COPD巨噬细胞24小时，再转染HMGB1siRNA24小时，然后再加入烟曲霉孢子刺激，检测TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-33炎性因子的mRNA表达水平进一步确定在COPD小鼠巨噬细胞中HMGB1是否是通过激活MyD88/NF-κB和syk/PI3K信号通路诱导炎症反应。如图2-13所示，与ControlsiRNA组相比，HMGB1siRNA组中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-33mRNA的表达水平明显降低，差异具有统计学意义（P均<0.05）；与HMGB1siRNA组相比，HMGB1+PDCT和HMGB1+R406组中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-33mRNA的表达水平明显增加，差异具有统计学意义（P均<0.05）。这些结果表明HMGB1下调后对炎性细胞的作用能够被PDTC和R406所减弱，这就进一步确-49- 第二军医大学博士学位论文定了在烟曲霉孢子诱导的炎症反应是通过上调HMGB1激活MyD88/NF-κB和syk/PI3K信号通路诱导的。图2-13HMGB1通过MyD88/NF-κB和syk/PI3K信号通路诱导炎症反应。将COPD小鼠巨噬细胞接种后过夜培养，加入PDTC或者R406培养24小时后，转染HMGB1siRNA继续培养24小时，加入烟曲霉孢子刺激24小时后，收集细胞，提取细胞的总RNA，逆转录成cDNA后，Real-timePCR检测细胞中TNF-α（A）、IL-1β（B）、IL-6（C）和IL-33（D）mRNA的表达水平。***P<0.001表示具有差异统计学意义。四、讨论COPD与肺实质和气道的慢性炎症密切相关，这些部位的炎症会在急性加重期进一步增加，并且和全身炎症紧密相连[102]，其中肺泡巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞等细胞数目会增加，且巨噬细胞在COPD患者的慢性炎症中发挥重要作用。有研-50- 慢性阻塞性肺疾病合并烟曲霉感染巨噬细胞炎症反应调控机制研究究报道，COPD患者的气道、肺实质、支气管灌洗液和痰液中巨噬细胞的数目可增加5-10倍[103]。巨噬细胞位于肺气肿患者受损肺泡壁的位置，其数量和肺实质与肺气肿损伤的严重程度具有明显的相关性。由于吸烟是COPD发生的一大诱因，故大量实验室研究均是通过吸烟来诱导COPD动物模型[104，105]。本实验中，我们使用吸烟诱导小鼠COPD模型，连续诱导8周后，发现其肺灌洗液中细胞总数明显增加，同时包括巨噬细胞在内的多种炎性细胞的数目也明显增加（图2-1），这都与之前的研究结果相一致。同时，我们又使用HE染色的方法对肺组织的进行了染色，染色结果显示COPD小鼠的肺组织结构发生了明显变化，支气管周围出现了明显的炎症反应，但是对照组小鼠的肺组织结构完全正常（图2-2A）。在COPD患者中发现细胞因子作为慢性炎症的一种重要介质[106]，稳定期COPD患者诱导的痰液中TNF-α的表达明显增加，在急性加重期它的表达进一步增加。而且在COPD患者的外周血单个核细胞中TNF-α的水平与明显增加[107]。IL-1β、IL-6和IL-33也是与COPD密切相关的细胞因子[108，109]，因此我们又对小鼠肺灌洗液进行了ELISA检测，结果显示肺灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-33等炎性细胞因子与正常对照组相比表达明显增加（图2-2B-2E）。这些结果均表明COPD小鼠模型成功建立。烟曲霉是空气中最为常见的腐生菌，孢子直径小，容易经呼吸道吸入。据报道正常情况下每人每天要吸入上百个烟曲霉孢子。由于健康人对于曲霉真菌具有完善的免疫防御系统，机体吸入曲霉孢子后，会产生一系列的免疫反应。孢子到达肺泡后，肺泡巨噬细胞将会识别并吞噬孢子。但是COPD患者因为机体的免疫缺陷，其巨噬细胞的吞噬功能受损，当曲霉孢子进入下呼吸道后会沉积到远端支气管，不能被巨噬细胞吞噬，进而对机体造成损伤[110]。故烟曲霉孢子不能被有效清除，导致严重的气道炎症发生[10-12]。最近研究显示，COPD合并侵袭性肺曲霉病的死亡率高达67%-100%[111-112]，但是目前对于这种疾病临床方面还没有明确有效的治疗手段。HMGB1是一个表达比较广泛的细胞核蛋白。它一旦被激活，就会被释放到细胞质中介导各种炎症反应[113]。先前的研究发现，吸烟的COPD患者的支气管灌洗液、上皮细胞和巨噬细胞中HMGB1的表达要比非患病的吸烟者和非吸烟的健康人明显增加[114]，并且在吸烟的COPD患者的血液和肺组织中HMGB1的增加量与肺功能受损程度相关[115]。Zhang等[101]的研究说明，当COPD患者的病情由急性加重期向恢复期转变时，血清中HMGB1的表达有明显降低。这些研究提示HMGB1的表达水平可能是COPD病情加重的一个潜在标志物。本研究发现在COPD组小鼠与正常组小鼠，其巨噬细胞中HMGB1的表达明显增加（图2-3），这与先前的研究结果相一致。本研究进一步探究了HMGB1在COPD合并入侵性肺曲霉病中可能的作用及机制。我们用烟曲霉孢子感染COPD小鼠巨噬细胞模拟COPD合并入侵性肺曲霉病模-51- 第二军医大学博士学位论文型，通过Real-timePCR和Westernblot检测发现，烟曲霉孢子感染的小鼠COPD巨噬细胞中HMGB1mRNA和蛋白水平表达较未感染的COPD小鼠巨噬细胞中的表达水平更高，同时，比烟曲霉孢子感染的正常小鼠巨噬细胞中的表达也明显升高（图2-4），这表明HMGB1的升高是COPD和烟曲霉孢子两者共同作用的结果。接下来我们使用RNA干扰技术在烟曲霉孢子感染的COPD巨噬细胞中下调HMGB1的表达，进一步探究HMGB1的作用及机制。从图2-5中看出，HMGB1siRNA明显下调了烟曲霉孢子感染的COPD小鼠巨噬细胞中HMGB1的表达。这为后面探究HMGB1在烟曲霉孢子感染的COPD小鼠巨噬细胞中的作用和机制提供了一定的前提条件。下调HMGB1的表达明显降低了烟曲霉孢子感染的COPD小鼠巨噬细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-33mRNA和蛋白水平的表达（图2-6和图2-7），这表明HMGB1能够介导烟曲霉孢子感染的COPD小鼠巨噬细胞的炎症反应。RAGE是HMGB1介导的炎症反应中的一个重要受体，在COPD中它的表达明显增加，在干细胞移植患者中S100B/RAGE信号通路是曲霉感染的一个重要途径[100,116]。但是我们的研究中仅发现RAGE在烟曲霉孢子感染的COPD小鼠巨噬细胞中的表达上调，而下调HMGB1对其表达并没有显著影响（图2-8和图2-9）。这表明在本研究中HMGB1诱导的炎症反应与RAGE受体无关。原来的研究显示TLRs的表达与COPD患者的肺功能损伤具有明显的相关性，它与能够被烟曲霉孢子感染[117-118]。TLR2和TLR4是HMGB1诱导炎症反应时重要的两个模式识别受体[119-120]。本研究结果显示TLR2和TLR4在烟曲霉孢子感染的COPD小鼠巨噬细胞中表达明显上调，下调HMGB1的表达能够下调这两个受体的表达水平。Dectin-1是一个跨膜蛋白，它是C型凝集素家族结构域家族7的一员，在先天性免疫系统中它属于非TLR模式识别受体[121]。原来的研究发现Dectin-1在抵抗烟曲霉感染的免疫反应中具有重要作用，而且它也是识别嗜血流感杆菌所必需的一个受体。嗜血流感杆菌是COPD患者呼吸道中一个重要的细菌病原体，能够诱导细胞因子的释放[122，123]。我们实验中表明Dectin-1在烟曲霉孢子感染后的COPD小鼠巨噬细胞中表达明显上调，下调HMGB1的表达能够下调Dectin-1体的表达水平（图2-8和2-9）。这表明HMGB1诱导的炎症反应与TLR2、TLR4和Dectin-1的表达上调相关。此外，我们又使用RNA干扰技术下调TLR2、TLR4和Dectin-1的表达，发现能够降低TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-33等炎性细胞因子的表达，这与下调HMGB1的作用效果相一致，这就进一步证实了在烟曲霉孢子感染的COPD小鼠巨噬细胞中HMGB1是通过TLR2、TLR4和Dectin-1受体诱导炎症反应的。我们又进一步探究了HMGB1诱导炎症反应可能相关的信号通路。MyD88和NF-κB是与TLR2/TLR4分子下游重要的信号通路[124，125]，因此我们检测MyD88、IκB、p65和p-p65的表达，来探究MyD88/NF-κB信号通路是否与HMGB1诱导的炎症反-52- 慢性阻塞性肺疾病合并烟曲霉感染巨噬细胞炎症反应调控机制研究应相关。IκB是NF-κB的抑制剂，它的降解能够激活NF-κB信号通路[126]。本研究结果发现下调HMGB1的表达明显降低了MyD88和p-p65的表达，上调IκB的表达（图2-11），这表明HMGB1能够诱导MyD88/NF-κB信号通路的活化。也有研究发现在巨噬细胞中Dectin-1和TLR1/4能够激活syk信号通路共同起始感染诱导炎症反应[127，128]。Syk和PI3K的活化对于炎性细胞因子的诱导至关重要[129]。因此我们也探究了syk/PI3K信号通路是否与HMGB1诱导的炎症反应相关。我们的结果显示，下调HMGB1的表达能够降低syk和PI3K的表达水平（图2-12）。此外，我们又使用NF-κB信号通路和Syk信号通路抑制剂进一步验证了HMGB1是否是通过这两条通路诱导炎症反应的。结果显示，两者的抑制剂均能够减弱HMGB1siRNA对TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-33等炎性细胞因子下调的作用效果。这就进一步证实了HMGB1是通过MyD88/NF-κB和syk/PI3K信号通路来诱导相关炎症反应的。总之，本研究发现烟曲霉孢子感染后COPD小鼠的巨噬细胞中HMGB1的表达增加。HMGB1通过与TLR2、TLR4和Dectin-1受体相互作用，进而激活MyD88/NF-κB和syk/PI3K信号通路，从而诱导巨噬细胞炎症反应。本研究进一步丰富了COPD合并入侵性肺曲霉病的发病机制，也为该疾病的临床治疗提供了分子靶点。五、本章小结本研究使用吸烟的方法构建小鼠COPD模型，8周后检测到小鼠肺灌洗液中总细胞数目及巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的个数均明显增加，肺灌洗液中TNF-、IL-1、IL-6和IL-33炎性因子表达明显增加，且肺组织切片中也发现有明显的炎症浸润情况，这均表明COPD模型小鼠成功建立。用烟曲霉孢子感染COPD小鼠巨噬细胞模拟COPD合并入侵性肺曲霉病模型，发现HMGB1的表达明显增加。通过RNA干扰技术下调HMGB1的表达进一步探究其在COPD合并入侵性肺曲霉病中的作用，发现下调HMGB1的表达能够明显降低烟曲霉孢子诱导的巨噬细胞炎症反应，能够降低TLR2/4和Dectin-1受体的表达，但是对RAGE受体的表达影响不大。下调TLR2/4和Dectin-1的表达也能够降低炎症反应，这与下调HMGB1的作用效果类似，这就进一步证明了HMGB1诱导的炎症反应与TLR2/4和Dectin-1受体相关。探究HMGB1诱导炎症的机制发现，HMGB1能够激活MyD88/NF-B和syk/PI3K信号通路，使用这两条信号通路的抑制剂能够减弱HMGB1下调对炎症的作用效果。总之，本研究结果表明烟曲霉孢子感染的COPD小鼠巨噬细胞中，HMGB1能够通过TLR2/4和Dectin-1受体激活MyD88/NF-B和syk/PI3K信号通路，从而诱导炎症反应。-53- 第二军医大学博士学位论文总结本项研究结果表明，一、从临床研究中，我们发现COPD患者巨噬细胞的吞噬功能受到抑制，可能与TLR4、MUC5AC表达增加及AQP5表达降低等有关；二、从基础机制出发阐述烟曲霉孢子感染的COPD小鼠巨噬细胞中，HMGB1能够通过TLR2/4和Dectin-1受体激活MyD88/NF-κB和syk/PI3K信号通路，从而诱导炎症反应。-54- 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慢性阻塞性肺疾病合并烟曲霉感染巨噬细胞炎症反应调控机制研究文献综述巨噬细胞在慢性阻塞性肺病发病机制中作用研究进展摘要：慢性阻塞性肺疾病是一类炎症有关的慢性疾病。目前其发病机制尚不明确，研究认为免疫关键细胞巨噬细胞与COPD的发生相关。巨噬细胞（Macrophage）是重要的免疫细胞，它们通过吞噬、分泌细胞炎性因子等作用，清除凋亡细胞碎片及解除有害物质毒性，促进防御和组织损伤修复，保持微环境平衡。巨噬细胞的功能受损必将对肺内免疫微环境产生影响。本文将从巨噬细胞数量及功能改变、分泌的细胞因子增多、组织修复重塑能力、解毒能力受损等方面展开论述，阐明巨噬细胞对COPD发病机制中的作用。关键词：慢性阻塞性肺病，巨噬细胞，COPD，机制慢性阻塞性肺病（Chronicobstructivepulmonarydisease，COPD）是以呼吸气流慢性阻塞为特点，影响外周气道，并与慢性支气管炎（粘液高分泌与杯状细胞和粘膜下腺增生）、肺气肿（气道实质的破坏），纤维化和组织损伤以及小气道的炎症有关的慢性炎性疾病[1]。慢性阻塞性肺病是世界上呼吸道疾病发病和死亡的主要原因，该病的发病率正在逐年增加[2]，每年耗费全球数十亿美元。预计2020年COPD将成为人类第三大死亡原因以及世界第五大最常见的致残原因[3]，在我国COPD是农村第一大死因，也是城乡居民病残和病死的主要疾病之一，COPD正逐渐成为严重的社会公共卫生问题。目前未找到治疗COPD有效的方法，糖皮质激素广泛用于COPD患者的治疗，尽管治疗结果良好，病人生活质量有所提高，但是长期吸入糖皮质激素的试验对肺功能衰退的改善作用并不明显[4]。COPD的发病原因目前不清楚，但吸烟是公认的COPD的主要危险因素[2]，据统计15％至20％的吸烟者会发展为COPD，其特征在于1秒内的呼气量（FEV1）不可逆的减少[5]。除此外污染，职业因素或可能存在的1-抗胰蛋白酶缺乏也是患病风险因素[6]。COPD的特征是不完全可逆的气流受限状态，气流受限与肺对有害颗粒或气体的异常炎症反应相关[6]。此外研究表明COPD个体患心血管、骨质疏松症及肌肉萎缩等疾病的风险增加。而系统性的炎症反应被证明可能与该类疾病的发病有关，系统性炎症越来越被认为是许多不同并发症的风险因素，包括动脉粥样硬化，恶病质，厌食和骨质疏松症。然而这些并发症常常在慢性阻塞性肺疾病-67- 第二军医大学博士学位论文患者中存在[7]。其中巨噬细胞是肺健康时期以及肺慢性炎症期间如COPD的主要防御细胞[8]。研究显示COPD患者的肺存在先天免疫功能障碍，这主要是由于巨噬细胞吞噬功能的缺陷。这种缺陷导致周期性细菌感染，引起COPD的急性加重[9]。巨噬细胞属于单核吞噬细胞系统（Mononuclearphagocytesystem，MPS）作为机体主要的防御细胞，在免疫、发育以及内稳态中发挥不同的功能，特别是在免疫反应中作为重要的先天免疫反应调节器而发挥重要作用，包括识别和处理感染性微生物，死亡细胞以及碎片等[10]。最新的研究表明巨噬细胞还能够扩散传递非免疫细胞之间的信息，如通过对斑马鱼的研究发现巨噬细胞可将蛋白囊泡凸起的信号远程传递至靶细胞，从而使斑马鱼色素细胞有序迁移从而形成条纹[10]。此外越来越多的证据巨噬细胞在COPD发病机理中起作用，特别是肺气肿，并且小气道中巨噬细胞的数量与肺实质损伤存在关联性[2,11]，此外，巨噬细胞参与调节COPD相关的炎症反应，巨噬细胞金属蛋白酶的表达受炎症细胞因子、基质碎片的高度调节。不同于存储有潜在快速释放能力的蛋白酶的中性粒细胞以及单核细胞，巨噬细胞负责监测以及响应微环境、负责组织重塑以及控制其他炎性事件[12]。1.巨噬细胞的功能及分类巨噬细胞源自循环单核细胞[2]，最初由Metchnikoff通过其吞噬性质被鉴定，包括高度吞噬细胞和它们的骨髓（BM）祖细胞。巨噬细胞是所有组织免疫系统最具可塑性的功能多样性细胞，在发育、代谢、组织修复以及免疫中发挥重要作用[13]。巨噬细胞是高度可塑的、并且在炎症因子诱导作用下发生分化异常。根据免疫状态可以将巨噬细胞分为两类，包括激活（AM）以及相对激活状态（AAM），或者是根据对细胞因子IFN-的反应以及TLR和IL4/IL13的活化状态分为M1和M2型[14]，两者极化功能几乎相互拮抗。其中M1分泌如白细胞介素-12（IL-12）、瘤坏死因子-（TNF-）等促炎细胞因子并具有良好的抗原呈递和驱动Th1免疫的能力，M2的特征表现为分泌抗炎介质如IL-10，促进T调节细胞的功能，与M1细胞相比，M2抗原呈递能力较差且具有高度吞噬的能力[15]。最近的一项研究发现健康吸烟者的AM表现出独特的极化模式，其特征在于显着抑制M1相关的炎症、免疫基因但诱导与组织重塑和免疫调节相关的各种M2极化程序相关的基因[16]。巨噬细胞的极化因多种因素的相互作用，是一个多种信号分子及其通路的相互调控的过程。Metchnikoff提出巨噬细胞参与组织完整性的维持和均衡。这使得巨噬细胞能够区分自身和非自身，感觉组织损伤，并识别入侵的病原体。然而，这些修复和稳态功能可能会被慢性损伤破坏，从而使巨噬细胞与疾病联系在一起，如纤维化、肥胖和癌症等[13]。-68- 慢性阻塞性肺疾病合并烟曲霉感染巨噬细胞炎症反应调控机制研究巨噬细胞具有产生弹性纤维溶解性半胱氨酸蛋白酶的能力，包括组织蛋白酶K、L和S，如果这些蛋白酶是由细胞分泌，特别是在酸性的环境中，他们能够引发严重的肺损伤。在1975年首次检测到巨噬细胞弹性蛋白酶12(MMP-12)[17]。MMP可以被脂多糖（LPS）、佛波酯、白细胞介素（IL）-1、血小板衍生生长因子（PDGF）和肿瘤坏死因子（TNF）刺激，这表明炎性刺激可能调节COPD气道MMP的活性[2]。此外MMP在肺气肿、以及与发育和炎症相关的组织重塑和修复中起主要作用[6]。如MMP-12可以降解不同的底物包括弹性蛋白，层粘连蛋白，IV型胶原，纤连蛋白，酪蛋白，所以MMP可能在肺气肿组织降解中起重要作用，并可通过细胞外基质对巨噬细胞迁移发挥作用。巨噬细胞在COPD中的作用越来越受到人们的关注，对巨噬细胞与COPD作用相关的研究可为COPD疾病的治疗及发病机制探索提供新的思路。本文将总结目前已有的关于巨噬细胞在COPD病程中的具体作用的研究进展。2.巨噬细胞在COPD病程中的作用2.1巨噬细胞数量及功能的改变COPD与气道中凋亡细胞增加和吞噬功能缺陷相关[18]。相关研究显示，吸烟者和COPD患者的肺泡巨噬细胞的数量明显增加，较正常对照组COPD患者有较高数目的巨噬细胞特别是气道上皮细胞中[19]。此外COPD中的细支气管上皮巨噬细胞增加[20]，并伴随着其他炎症细胞的大量涌入，如嗜中性粒细胞和细胞毒性T淋巴细胞数量增加、平滑肌质量的增加,细胞外基质的沉积[5,19]。但是研究还显示虽然COPD患者巨噬细胞数量及活性升高，但是其吞噬功能受损，吞噬清除凋亡物质的能力受损可能是导致COPD发病机制的另一个因素[21]，而多种炎症介质的释放（脂质，趋化因子，细胞因子，生长因子，反应性氧中间物）也明显增加[22,23]，从而加重了炎症反应。风险因素香烟可引发气道炎症并且增加肺泡巨噬细胞的数量，而这两者均会导致肺气肿[2]。目前的COPD治疗药物之一的阿奇霉素具有抗炎性质，能够调节促炎细胞因子的产生[24]。在阿奇霉素作用下，通过胶原凝集素蛋白途径促进巨噬细胞吞噬侵袭性病原体，从而改善所摄取的肺泡巨噬细胞的吞噬功能及吞噬活性，较低剂量的阿奇霉素也可明显改善肺泡巨噬细胞的吞噬功能，并且伴随外周血中的炎症标志物的减少[24,25]。单核细胞趋化蛋白1（Monocytechemoattractantprotein，MCP-1）作为单核巨噬细胞特有的趋化因子，研究表明相较于正常对照组，COPD模型鼠AEC细胞内MCP-1显著增加[26]，而细支气管上皮过度表达MCP-1。MCP-1对于单核细胞成为巨噬细胞-69- 第二军医大学博士学位论文发挥着关键性作用。所以COPD患者MCP-1增多趋化活性增强可能是巨噬细胞数量增多的原因。2.2巨噬细胞分泌的细胞因子增多巨噬细胞是许多关键炎症性细胞因子的重要来源，其分泌物也被认为是自身免疫炎症的重要驱动因子，包括白细胞介素IL17，IL12，IL18，IL23和TNF-[13]。Sergejeva等通过体外实验研究发现，白细胞介素17（IL-17）诱导血液单核细胞的迁移并延长气道巨噬细胞的存活时间。IL-17在过敏原诱导的气道炎症期促进巨噬细胞募集和存活并直接作用于气道巨噬细胞吞噬功能发挥作用[27]，此外IL-17参与控制巨噬细胞和嗜中性粒细胞在过敏原原诱导的气道炎症中的蛋白水解活性。过敏原刺激后IL-17A减少了气道嗜中性粒细胞和巨噬细胞的数量，IL-17A还在体内增加了Fas-抗原在气道巨噬细胞中的表达。最后，通过气道嗜中性粒细胞和巨噬细胞体内MMP-9的表达被-IL-17下调。这表明内源性IL-17介导过敏原诱导的气道炎症期间巨噬细胞的积累[27]。香烟烟雾，LPS（香烟烟雾中的污染物），以及细胞因子TGF-，IL-8和TNF-的产出增加等因素会潜在导致小气道上皮细胞凋亡增加和上皮细胞/基质的破坏。其中TNF-是一种主要由巨噬细胞分泌的具有广泛生物学活性的细胞因子,可以促进COPD气道炎症的发生,在香烟烟雾、感染等条件刺激下释放，它参与对刺激如细胞因子和应激的细胞应答，并且在调节对感染的免疫应答中起关键作用。在高表达TNF-的小鼠中表现出肺泡腔扩大、肺弹性回缩丧失等病理生理改变，提示TNF-能够促进肺气肿的发展[28]。2.3巨噬细胞组织修复重塑能力受损巨噬细胞在组织重塑中起关键作用，先前由不同组织巨噬细胞重塑缺陷引发的疾病已经得到很多研究[13]，如在红细胞生成期间，成熟的成红细胞通过被巨噬细胞包围吞噬从而挤出红细胞核，而巨噬细胞缺乏时，红细胞生成将被阻断[29]。慢性炎症COPD的病理改变除了涉及不同部位特定炎症细胞的增加，还表现出由反复损伤和修复引发的结构变化，即气道重塑，这与巨噬细胞的作用是密不可分的，而正常修复防御机制的破坏还进一步导致小气道纤维化，这种病理变化导致空气滞留和进行性气流限制，进而呼吸困难并合并COPD其他的特征性症状。自-1-抗胰蛋白酶缺乏研究开展以来，蛋白酶与抗蛋白酶失衡已成为肺气肿发病机理中最为广泛接受的理论。疾病过程中涉及许多蛋白水解酶，包括具有降解弹性蛋白和胶原蛋白能力的MMP[30]。MMP包括至少20种在组织重塑中起重要作用的蛋白水解酶，其特征为可以以无活性酶原分泌，激活后即可实现蛋白水解，此外其活性酶-70- 慢性阻塞性肺疾病合并烟曲霉感染巨噬细胞炎症反应调控机制研究都可以被金属蛋白酶的组织抑制剂（TIMPs）抑制。该蛋白酶家族可以破坏细胞外基质的所有蛋白质[31]。其中MMP1（间质胶原酶），MMP9（明胶酶B）和MMP12（巨噬细胞弹性蛋白酶）在COPD患者肺气肿的发展中发挥重要的作用[32]，一旦被激活，就可以破坏结缔组织[31]。MMP-1作为MMP家族中最丰富的蛋白酶之一，能够降解肺内最丰富的蛋白质I，II和III型胶原[33]。而肺泡巨噬细胞是肺中负责MMP-1表达的一种重要细胞类型[34]。COPD患者及吸烟者肺中巨噬细胞可产生大量的MMP-9，MMP-7以及MMP-12，从而可以降解弹性蛋白[31]，而在正常巨噬细胞中的MMP水平非常低。并且研究表明肺泡巨噬细胞MMP-1染色的程度与肺气肺表面积/体积比值定性估计有关[33]。所以MMP-1可能是COPD巨噬细胞中肺破坏的重要酶标志[34]。此外MMP表达受炎症细胞因子的高度调节，如白细胞介素和TNF也都能刺激MMP的合成和分泌。其中血小板衍生生长因子（PDGF），成纤维细胞生长因子（FGF）和表皮生长因子（EGF）可上调某些MMP表达，而IL-4，IL-13，IL-10和转化生长因子TGF-通常可以下调MMP。除此外在正常肺中，细胞更新，损伤上皮细胞的修复是高度调节的过程，一旦修复过程完成后多余的AEC会被移除。这个过程涉及相邻肺泡巨噬细胞（AM）的吞噬作用后AEC的细胞凋亡，过量凋亡可导致异常的细胞丢失，组织破坏和炎症，未清除的凋亡细胞可能发生继发性坏死释放有害细胞内容物如乳酸脱氢酶增加，已有研究表明过度凋亡和清除率降低与肺气肿有关[21]。所以巨噬细胞可以通过多种途径影响MMP的生成，从而对组织修复重塑能力产生影响[31]。2.4巨噬细胞解毒能力受损巨噬细胞在COPD的发病机制中起重要作用，因为肺巨噬细胞是各种抗氧化和解毒酶的来源之一。肺巨噬细胞可防止机体吸入颗粒，通过吞噬沉积颗粒以及酶的代谢活化使吸入的有机部分解毒[20]，这个过程部分是因为巨噬细胞可以产生许多NF-E2相关因子2基因（Nrf2）调节的抗氧化剂[35-37]，而气管内弹性蛋白酶治疗显示可以上调肺泡巨噬细胞内Nrf2的靶基因[20]。其中Nrf2是调节几种抗氧化和解毒基因表达的一个关键转录因子[36]。其通过与另一种碱性亮氨酸拉链蛋白，如小Maf（MafF，MafG和MafK）或Jun（c-Jun，Jun-D和Jun-B）形成异源二聚体，然后结合到目标基因启动子的抗氧化反应元件（ARE），通过ARE调节一组解毒酶（例如谷胱甘肽S-转移酶和NAD(P)H：醌氧化还原酶）的诱导型表达[36]。当小鼠缺陷Nrf2时对氧化应激和反应性亲电体高度易感，而暴露于香烟烟雾或弹性蛋白酶时会发展为严重的肺气肿。此外研究表明Nrf2的特异性激活剂还可以诱导巨噬细胞中白细胞蛋白酶抑制剂（SLPI）基因的表达[35]。所以这些结果表明Nrf2不仅可调节氧化剂与抗氧化剂的平-71- 第二军医大学博士学位论文衡，而且可通过调节炎症和蛋白酶与抗蛋白酶平衡来防止肺疾病的发展[35]，而巨噬细胞解毒能力丧失或许主要是Nrf2依赖性系统异常的结果。3．小结COPD的病理特征性改变存在于中央气道、外周气道、肺实质结构以及肺血管系统。COPD的发病原因错综复杂，而炎症在COPD的发病机制中处于重要的地位。目前已经明确多种炎症相关细胞和气道结构细胞以及其分泌的多种炎症性因子参与慢性气道炎症、肺气肿、气道重塑的发生发展。COPD的发生发展与机体炎症反应密切相关，巨噬细胞被认为通过多种机制维持体内代谢平衡，通过巨噬细胞的调节作用，机体能够适应其微环境变化。例如，在细菌感染期间，巨噬细胞的激活导致促炎症的先天分泌细胞因子，如TNF-，IL6和IL1能有效防御细菌和病毒病原体入侵。当组织在感染或损伤后受损时，炎性单核细胞募集迁移并分化成巨噬细胞进入受影响的组织，这些募集的巨噬细胞通常表现出伤口愈合反应的早期阶段的促炎症表型，并分泌各种炎症介质，包括TNF-，IL1和一氧化氮（NO），从而活化抗微生物剂防御机制，其中包括有助于杀伤侵入生物体的氧化过程。它们还产生IL-12和IL-23，其指导分化有助于驱动炎症反应的抗微生物TH1和TH17细胞的扩增。作为调节和促进炎症过程的关键细胞。巨噬细胞在COPD患者肺组织中数量和浓度是明显增高的。在COPD发展过程中，巨噬细胞的数量及免疫活性发生改变，巨噬细胞吞噬清除功能受损，抗原提呈作用由强变弱，且分泌的细胞因子等使机体的免疫系统失衡，伴随肺微环境的改变，进而导致炎症病变的发生。巨噬细胞在COPD的发病中起到了关键的作用，深入探讨了巨噬细胞的在COPD发展中的作用及机制，不仅为COPD发病机制研究提供理论依据，而且还可以巨噬细胞为出发点，为COPD现代诊断和治疗提供新思路和方向。-72- 慢性阻塞性肺疾病合并烟曲霉感染巨噬细胞炎症反应调控机制研究参考文献：[1]K.F.Chung.Cytokinesinchronicobstructivepulmonarydisease.EurRespirJSuppl,2001,34:50s-59s.[2]R.E.Russell,S.V.Culpitt,C.DeMatos,L.Donnelly,M.Smith,J.Wiggins,P.J.Barnes.Releaseandactivityofmatrixmetalloproteinase-9andtissueinhibitorofmetalloproteinase-1byalveolarmacrophagesfrompatientswithchronicobstructivepulmonarydisease.AmJRespirCellMolBiol,2002,26(5):602-9.[3]A.D.Lopez,C.C.Murray.Theglobalburdenofdisease,1990-2020.NatMed,1998,4(11):1241-3.[4]D.S.Postma,H.A.Kerstjens.Areinhaledglucocorticosteroidseffectiveinchronicobstructivepulmonarydisease?AmJRespirCritCareMed,1999,160(5Pt2):S66-71.[5]W.F.Grashoff,J.K.Sont,P.J.Sterk,P.S.Hiemstra,W.I.deBoer,J.Stolk,J.Han,J.M.vanKrieken.Chronicobstructivepulmonarydisease:roleofbronchiolarmastcellsandmacrophages.AmJPathol,1997,151(6):1785-90.[6]S.Molet,C.Belleguic,H.Lena,N.Germain,C.P.Bertrand,S.D.Shapiro,J.M.Planquois,P.Delaval,V.Lagente.Increaseinmacrophageelastase(MMP-12)inlungsfrompatientswithchronicobstructivepulmonarydisease.InflammRes,2005,54(1):31-6.[7]W.Q.Gan,S.F.Man,A.Senthilselvan,D.D.Sin.Associationbetweenchronicobstructivepulmonarydiseaseandsystemicinflammation:asystematicreviewandameta-analysis.Thorax,2004,59(7):574-80.[8]STEVEND.SHAPIRO.TheMacrophageinChronicObstructivePulmonaryDisease.AmJRespirCritCareMed,1999:3.[9]C.J.Harvey,R.K.Thimmulappa,S.Sethi,X.Kong,L.Yarmus,R.H.Brown,D.Feller-Kopman,R.Wise,S.Biswal.TargetingNrf2signalingimprovesbacterialclearancebyalveolarmacrophagesinpatientswithCOPDandinamousemodel.SciTranslMed,2011,3(78):78ra32.[10]D.S.Eom,D.M.Parichy.Amacrophagerelayforlong-distancesignalingduringpostembryonictissueremodeling.Science,2017,[11]T.C.O'Shaughnessy,T.W.Ansari,N.C.Barnes,P.K.Jeffery.Inflammationinbronchialbiopsiesofsubjectswithchronicbronchitis:inverserelationshipofCD8+TlymphocyteswithFEV1.AmJRespirCritCareMed,1997,155(3):852-7.[12]STEVEND，SHAPIRO.TheMacrophageinChronicObstructivePulmonaryDisease.AmJ-73- 第二军医大学博士学位论文RespirCritCareMed1999,160:3.[13]T.A.Wynn,A.Chawla,J.W.Pollard.Macrophagebiologyindevelopment,homeostasisanddisease.Nature,2013,496(7446):445-55.[14]S.Gordon.Alternativeactivationofmacrophages.NatRevImmunol,2003,3(1):23-35.[15]L.I.Kunz,T.S.Lapperre,J.B.Snoeck-Stroband,S.E.Budulac,W.Timens,S.vanWijngaarden,J.A.Schrumpf,K.F.Rabe,D.S.Postma,P.J.Sterk,P.S.Hiemstra,GroupGroningenLeidenUniversitiesCorticosteroidsinObstructiveLungDiseaseStudy.Smokingstatusandanti-inflammatorymacrophagesinbronchoalveolarlavageandinducedsputuminCOPD.RespirRes,2011,12:34.[16]R.Shaykhiev,A.Krause,J.Salit,Y.Strulovici-Barel,B.G.Harvey,T.P.O'Connor,R.G.Crystal.Smoking-dependentreprogrammingofalveolarmacrophagepolarization:implicationforpathogenesisofchronicobstructivepulmonarydisease.JImmunol,2009,183(4):2867-83.[17]STEVEND，SHAPIRO.TheMacrophageinChronicObstructivePulmonaryDisease.AmJRespirCritCareMed,1999,160:3.[18]E.P.Gora.[Individualcharacteristicsofhumanrespirationduringsleepataheightof4200m].KosmBiolAviakosmMed,1984,18(3):93-5.[19]W.I.deBoer,A.vanSchadewijk,J.K.Sont,H.S.Sharma,J.Stolk,P.S.Hiemstra,J.H.vanKrieken.Transforminggrowthfactorbeta1andrecruitmentofmacrophagesandmastcellsinairwaysinchronicobstructivepulmonarydisease.AmJRespirCritCareMed,1998,158(6):1951-7.[20]M.Suzuki,T.Betsuyaku,Y.Ito,K.Nagai,Y.Nasuhara,K.Kaga,S.Kondo,M.Nishimura.Down-regulatedNF-E2-relatedfactor2inpulmonarymacrophagesofagedsmokersandpatientswithchronicobstructivepulmonarydisease.AmJRespirCellMolBiol,2008,39(6):673-82.[21]S.Hodge,G.Hodge,R.Scicchitano,P.N.Reynolds,M.Holmes.Alveolarmacrophagesfromsubjectswithchronicobstructivepulmonarydiseasearedeficientintheirabilitytophagocytoseapoptoticairwayepithelialcells.ImmunolCellBiol,2003,81(4):289-96.[22]P.J.Barnes,S.D.Shapiro,R.A.Pauwels.Chronicobstructivepulmonarydisease:molecularandcellularmechanisms.EurRespirJ,2003,22(4):672-88.[23]S.Letuve,A.Kozhich,N.Arouche,M.Grandsaigne,J.Reed,M.C.Dombret,P.A.Kiener,M.Aubier,A.J.Coyle,M.Pretolani.YKL-40iselevatedinpatientswithchronicobstructivepulmonarydiseaseandactivatesalveolarmacrophages.JImmunol,2008,181(7):5167-73.[24]S.Hodge,G.Hodge,S.Brozyna,H.Jersmann,M.Holmes,P.N.Reynolds.Azithromycin-74- 慢性阻塞性肺疾病合并烟曲霉感染巨噬细胞炎症反应调控机制研究increasesphagocytosisofapoptoticbronchialepithelialcellsbyalveolarmacrophages.EurRespirJ,2006,28(3):486-95.[25]S.Hodge,G.Hodge,H.Jersmann,G.Matthews,J.Ahern,M.Holmes,P.N.Reynolds.Azithromycinimprovesmacrophagephagocyticfunctionandexpressionofmannosereceptorinchronicobstructivepulmonarydisease.AmJRespirCritCareMed,2008,178(2):139-48.[26]L.Gan,C.Li,J.Wang,X.Guo.CurcuminmodulatestheeffectofhistonemodificationontheexpressionofchemokinesbytypeIIalveolarepithelialcellsinaratCOPDmodel.IntJChronObstructPulmonDis,2016,11:2765-2773.[27]S.Sergejeva,S.Ivanov,J.Lotvall,A.Linden.Interleukin-17asarecruitmentandsurvivalfactorforairwaymacrophagesinallergicairwayinflammation.AmJRespirCellMolBiol,2005,33(3):248-53.[28]M.Fujita,J.M.Shannon,C.G.Irvin,K.A.Fagan,C.Cool,A.Augustin,R.J.Mason.Overexpressionoftumornecrosisfactor-alphaproducesanincreaseinlungvolumesandpulmonaryhypertension.AmJPhysiolLungCellMolPhysiol,2001,280(1):L39-49.[29]K.Kawane,H.Fukuyama,G.Kondoh,J.Takeda,Y.Ohsawa,Y.Uchiyama,S.Nagata.RequirementofDNaseIIfordefinitiveerythropoiesisinthemousefetalliver.Science,2001,292(5521):1546-9.[30]J.C.Hogg,P.T.Macklem,W.M.Thurlbeck.Siteandnatureofairwayobstructioninchronicobstructivelungdisease.NEnglJMed,1968,278(25):1355-60.[31]T.Cawston,S.Carrere,J.Catterall,R.Duggleby,S.Elliott,B.Shingleton,A.Rowan.MatrixmetalloproteinasesandTIMPs:propertiesandimplicationsforthetreatmentofchronicobstructivepulmonarydisease.NovartisFoundSymp,2001,234:205-18;discussion218-28.[32]L.Joos,J.Q.He,M.B.Shepherdson,J.E.Connett,N.R.Anthonisen,P.D.Pare,A.J.Sandford.Theroleofmatrixmetalloproteinasepolymorphismsintherateofdeclineinlungfunction.HumMolGenet,2002,11(5):569-76.[33]A.M.Wallace,L.B.Loy,R.T.Abboud,J.M.D'Armiento,H.O.Coxson,N.L.Muller,S.Kalloger,X.Li,W.MarkElliott,J.C.English,R.J.Finley,P.D.Pare.Expressionofmatrixmetalloproteinase-1inalveolarmacrophages,typeIIpneumocytes,andairwaysinsmokers:relationshiptolungfunctionandemphysema.Lung,2014,192(4):467-72.[34]K.Imai,S.S.Dalal,E.S.Chen,R.Downey,L.L.Schulman,M.Ginsburg,J.D'Armiento.Humancollagenase(matrixmetalloproteinase-1)expressioninthelungsofpatientswithemphysema.AmJRespirCritCareMed,2001,163(3Pt1):786-91.[35]T.Iizuka,Y.Ishii,K.Itoh,T.Kiwamoto,T.Kimura,Y.Matsuno,Y.Morishima,A.E.Hegab,S.-75- 第二军医大学博士学位论文Homma,A.Nomura,T.Sakamoto,M.Shimura,A.Yoshida,M.Yamamoto,K.Sekizawa.Nrf2-deficientmicearehighlysusceptibletocigarettesmoke-inducedemphysema.GenesCells,2005,10(12):1113-25.[36]T.Ishii,K.Itoh,S.Takahashi,H.Sato,T.Yanagawa,Y.Katoh,S.Bannai,M.Yamamoto.TranscriptionfactorNrf2coordinatelyregulatesagroupofoxidativestress-induciblegenesinmacrophages.JBiolChem,2000,275(21):16023-9.[37]F.Y.Jin,C.Nathan,D.Radzioch,A.Ding.Secretoryleukocyteproteaseinhibitor:amacrophageproductinducedbyandantagonistictobacteriallipopolysaccharide.Cell,1997,88(3):417-26.-76- 慢性阻塞性肺疾病合并烟曲霉感染巨噬细胞炎症反应调控机制研究在读期间学习工作情况本人2014年通过在职博士入学考试进入第二军医大学学习，攻读博士期间一直从事COPD、肺部真菌感染等相关基础和临床研究工作。因为是在职读博，还是要完成日常的临床工作，干部病区的工作相对来说要轻松一些，再加上脱产的一段时间，以及同事们的协助，得以完成课题研究。已经在核心期刊发表了一篇综述，一篇中文论著，同时一篇英文论著已经被接收（ExperimentalandTherapeuticMedicine），另一篇英文文章还在投稿中。在读期间，获得了一项院内课题资助，并参与获得全军保健课题一项。附在读期间发表文章：1．慢性阻塞性肺病患者巨噬细胞功能与受体表达的关系研究收录期刊：现代生物医学进展核心期刊第一作者2.COPD合并GERD的研究现状收录期刊：医学临床研究核心期刊第一作者3.Toll-likereceptor2andDectin-1actaspromisingbiomarkerforaspergillusfumigatusinfecition收录期刊：ExperimentalandTherapeuticMedicine第一作者SCI（已接受）4.HMGB1mediatestheproinflammatoryimmuneresponsetoAspergillusfumigatusinalveolarmacrophages收录期刊：MicrobialPathogenesis第一作者SCI（修回）-77- 第二军医大学博士学位论文致谢能够在临床工作十余年后，再能有机会攻读博士学位，我已经感到非常幸运，重回到校园，我已人到中年，三年时间，转瞬即逝，如今又到了毕业离别之际。这三年，我更坚定了自己的目标，并要感谢这一路走来帮助和关心我的人。首先感谢导师施毅教授，是您，鼓励我再次踏上校园之路。导师严谨的治学态度、精湛的医术、高尚的医德、坚韧的意志品质、睿智的思维无时无刻在鼓舞着我，在人生路口给予我信心，指引我前进。衷心感谢导师给予我研究学习的悉心指导，非常荣幸能成为您的学生。特别感谢南京总医院呼吸内科苏欣教授在课题设计、实验实施、论文撰写和学习工作过程中给予的鼎力帮助和热忱指导。感谢南京总医院干部呼吸内科辛晓峰主任、呼吸内科苏欣主任、张方主任、徐小勇副主任医师、朱美英秘书、朱素华秘书及呼吸内科全体老师对我临床和科研工作的支持和帮助。感谢一起工作学习的师兄弟姐妹：吴婷、孙文逵、方丽萍、江浩、沈思梅、何骞、李培、陈永铭、沈小玥等在课题设计、实验过程中给予的帮助，谨此表示我最诚挚的谢意!感谢我的家人，一直默默的在背后支持我、鼓励我，谢谢我的亲人！-78-
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