瘦素对猪卵巢颗粒细胞增殖与凋亡的影响及机制研究

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1、硕士学位论文瘦素对猪卵巢颗粒细胞增殖与凋亡的影响及机制研究研究生姓名王慧指导教师田科雄教授学科专业动物营养与饲料科学研究方向饲料资源开发与利用二○一七年四月分类号密级UDC单位代码湖南农业大学硕士学位论文瘦素对猪卵巢颗粒细胞增殖与凋亡的影响及机制研究Effectsofleptinonproliferationandapop-tosisofporcineovariangranulosacellsanditsmechanism研究生姓名王慧指导教师田科雄教授学科专业动物营养与饲料科学研究方向饲料资源开发与利用论文答辩日期2017.6.1答辩

2、委员会主席卢向阳论文评阅人姚康、熊霞、刘玉兰二○一七年六月摘要瘦素是一种主要由白色脂肪组织分泌的激素，可作用于下丘脑调节能量平衡，维持体重稳定。近年来，越来越多的证据表明瘦素可以通过作用于下丘脑-垂体-性腺轴调节机体的生殖功能。本试验通过培养原代猪卵巢颗粒细胞，研究瘦素诱导的颗粒细胞的增殖与凋亡，以及瘦素刺激下颗粒细胞雌二醇与孕酮的分泌，探讨其作用机制。试验结果包括以下几个部分：1、猪卵巢颗粒细胞的原代培养及鉴定。选取体重为100kg左右的健康母猪卵巢，无菌条件下，用1mL一次性注射器抽取卵泡液，获得颗粒细胞后于37℃饱和湿度的CO2培

3、养箱中培养，FSHR抗体免疫荧光鉴定颗粒细胞的纯度。分离得到的颗粒细胞呈多边形、星状，后期逐渐转变为纤维状；免疫荧光鉴定分离的细胞纯度>98%；绘制颗粒细胞7天内的生长曲线发现细胞在贴壁48h到120h之间都处于增殖上升期，120h后增长呈下降趋势。2、瘦素对颗粒细胞增殖、凋亡及分泌功能的影响。用0、1、10、50、100ng/mL瘦素处理卵巢颗粒细胞，发现细胞培养24h后，不同浓度瘦素均能刺激颗粒细胞的增殖（P<0.05），培养48h后，仅100ng/mL瘦素能显著促进颗粒细胞的增殖（P<0.05）；细胞凋亡数据显示，10、100ng

4、/mL瘦素显著抑制了颗粒细胞的早期凋亡（P<0.05），对颗粒细胞的晚期凋亡和总凋亡率无明显作用（P>0.05）；不同浓度的瘦素对调控颗粒细胞E2与P4的分泌无显著影响（P>0.05）。3、实时荧光定量PCR检测ob-Rb、pi3k/akt信号通路中pi3k、akt1、akt2的mRNA表达以及细胞凋亡相关因子Bcl-2、Bax、Bad、Caspase-3的mRNA表达量。结果显示，与对照组相比，1、50ng/mL瘦素处理组显著提高了ob-Rb的mRNA表达（P<0.05）；10、50ng/mL瘦素显著上调了pi3k/akt信号通路中p

5、i3k的mRNA表达（P<0.05）；10ng/mL瘦素显著上调了akt1的mRNA表达（P<0.05）；1ng/mL瘦素显著上调了akt2的mRNA表达（P<0.05）。瘦素对颗粒细胞中Bcl-2的表达量无显著影响（P>0.05）；1ng/mL瘦素可提高细胞中Bax的mRNA表达（P<0.05），其余各组均有降低Bax表达的趋势，但差异不显著（P>0.05）；50ng/mL瘦素可显著提高Bcl-2与Bax的比值（P<0.05）；1ng/mL的瘦素显著上调了Bad的mRNA表达（P<0.05），10~100ng/mL瘦素均可显著下调Ba

6、d的mRNA表达I（P<0.05）。与对照组相比，10-100ng/mL的瘦素均显著降低了Caspase-3的mRNA表达量（P<0.05）。结论：瘦素能刺激颗粒细胞的增殖，抑制其凋亡，可能是通过作用于pi3k/akt通路调控凋亡因子Bad、Caspase-3的表达，提高Bcl-2/Bax的比值来实现的。关键词：瘦素；卵巢颗粒细胞；增殖；凋亡；信号通路IIAbstractLeptinisahormonesecretedmainlybywhiteadiposetissue.Itcanregulatethebalanceofenergyan

7、dmaintainthestabilityofbodyweight.Inrecentyears,agrowingbodyofevidencesuggeststhatleptincanregulatethereproductivefunctionbyactingonthehypothalamuspituitarygonadaxis.Inthisstudy,weinvestigatedtheproliferationandapoptosisofovariangranulosacellsinducedbyleptinandthesecreti

8、onofestradiolandprogesteroneinovariangranulosacellsstimulatedbyleptin.Theresultsofthestudyincludethefol