山羊痘病毒感染细胞micrornas的筛选、鉴定及其在早期诊断中的应用初探

《山羊痘病毒感染细胞micrornas的筛选、鉴定及其在早期诊断中的应用初探》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、密级：论文编号:中囯农业科学院学位论文山羊痘病毒感染细胞microRNAs的筛选、鉴定及其在早期诊断中的应用初探ScreeningandIdentificationofCellularmicroRNAsInvolvedintheInfectionofGoatpoxVirusandItsApplicationinEarlyDetection硕士研究生.•高泽乾指导教师:窦永喜副研究员申请学位类别:兽医硕士专业领域名称:兽医培养单位:兰州兽医研究所研究生院2015年5月Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationS

2、creeningandIdentificationofCellularmicroRNAsInvolvedintheInfectionofGoatpoxVirusandItsApplicationinEarlyDetectionM.S.Candidate：GaoZeqianSupervisor：AssociateProf.DouYongxiDegree：MasterofVeterinarianSpecialty:VeterinarianMay2015摘要microRNAs（miRNAs）是一类长度约为22nt的非编码小RNA分子，可以通过结合靶基因信使RNA（messagerRNA，m

3、RNA）的3'UTR，5'UTR甚至蛋白质编码区域，影响mRNA的稳定性或抑制mRNA的翻译过程，从而调控靶基因所参与的细胞生物学过程。已有多项研究表明宿主细胞miRNA可以在不同水平上调控感染相关信号通路来调控病毒的生命周期。但是关于miRNA在痘病毒感染方面的研究较少，本实验以山羊痘病毒（Goatpoxvirus，GPV）作为研究对象，探究宿主细胞miRNA在山羊痘病毒感染过程中的作用。本论文采用Illumina/Solexa高通量测序平台对山羊痘病毒侵染的绵羊睾丸（LambTesticle，LT）细胞进行miRNA测序，并对测序数据进行了质量检测和长度分布统计，筛选出差异性表达

4、的miRNA分子。在此基础上，采用定量PCR方法描述目的miRNA分子mir-365-3p和mir-365-5p在感染不同时期表达水平变化。通过TargetScan靶基因预测、GeneOnthology（GO）注释分析以及KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes（KEGG）信号通路富集分析，探索mir-365-3p和mir-365-5p在GPV感染过程中可能行使的功能。之后还探究了mir-365-3p和mir-365-5p作为山羊痘病毒感染早期分子诊断标记的可能。主要结果如下：-4.67（1）制作LT原代细胞，并测定山羊痘病毒GH株TCID50=10/10

5、0μL。（2）检测了山羊痘病毒感染4h的LT细胞中miRNA合成途径中关键蛋白Dicer和Argonaute-2（AGO-2）的表达情况，结果发现Dicer蛋白呈上调趋势，而AGO-2表达状态无明显改变。（3）本研究通过Illumina/Solexa高通量测序平台测定了GH株山羊痘病毒感染LT细胞4h后宿主细胞的小RNA转录组，总共鉴定出91个差异性表达的miRNAs，其中47个为绵羊新发现的miRNAs。与未感染组相比，这些差异性表达的miRNAs分子中，有48个miRNAs下调，43个miRNAs上调。（4）检测了在山羊痘病毒感染0-48h期间，mir-365-5p和mi-365

6、-3p的表达情况：mir-365-5p主要呈下降趋势，而mir-365-3p则是在0h-10h之间呈上升趋势，10h-48h呈下降趋势。（5）利用TargetScan对mir-365-5p和mir-365-3p的靶基因预测，共得到mir-365-5p的靶基因131个，mir-365-3p的靶基因275个。通过基因本体论GO分析发现mir-365-3p靶基因分子功能主要富集在蛋白质结合，核酸结合以及转录调控因子活性，其生物学过程主要富集在转录调控和细胞基础代谢过程。而mir-365-5p靶基因分子功能主要蛋白质结合，其生物学过程主要富集于蛋白质代谢过程。通过KEGG分析发现mir-36

7、5-3p的靶基因信号转导通路显著富集于细胞骨架调控、趋化因子信号通路、Wnt信号通路和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase，MAPK）信号通路，而mir-365-5p的靶基因信号转导通路显著富集于泛素介导的蛋白质降解信号通路和ErbB信号通路。（6）人工接种山羊痘病毒GH株于绵羊肋部表皮和大腿内侧表皮，感染3天后检测肝脏、肺脏、瘤胃和皮肤的mir-365-5p和mir-365-3p的表达情况。结果表明，mir-3