小鼠肝细胞AMPK相关microRNAs的筛选及功能研究

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1、分类号：R587．1密级：学位类别：科学学位口专业学位囤冒学校代码：10062学号：2010601099学科门类：医学又坪眚科袁号博士学位论文DoCToRALDISSERTATIoN论文题目：小鼠肝细胞AMPK相关microRNAs的筛选及功能研究TITLEAMPK-relatedmicroRNAsexpressionprofileinmousehepatocytesandfunctionresearch一级学科：临床医学二级学科：内科学内分泌与代谢病论文作者：刘佳指导教师：张宏教授导师组成员：邸阜生主任医师李红涛主任医师天津医科大学研究生院

2、二。一三年五月学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：学位论文版权使用授权书日期p哆年，肛日本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家

3、有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。保密口，在——年解密后适用本授权书。本论文属于不保密函。(请在相对应的方框内打“√”)学位论文作者签名：导师签名：Et期：为／弓年厂月M日日期：励；钉锄日天津医科大学博士学位论文中文摘要目的：腺苷酸活化蛋白激酶(adenosinemonophosphate—activatedproteinkinase，AMPK)是细胞适应环境和营养变化的核心，肝脏是碳水化合物储存和释放最重要的器官。microRNAs(miRNAs)是一组新发现的小分子RNA，几乎可以作用于机体包括能量代谢的各个重要的生命过程。本研究

4、拟筛选小鼠肝细胞中参与AMPK信号传导途径的miRNAs，通过生物信息学方法寻找可能参与AMPK对能量代谢有调控作用的miRNAs，预测其靶基因及可能的生物学功能，并进一步验证其在AMPK调节肝糖代谢中发挥的作用。方法：1．肝细胞AMPK相关miRNAs的筛选：雄性C57BL／6小鼠原代肝细胞体外培养，双丁酰环腺苷酸(dibutyryl—cyclicadenosinemonophosphate，Btz·cAMP)干预作为Bt2一cAMP组，实验组再加入不同浓度(O．125mM、0．25raM、0．5mM、lmM)的5．氨基咪唑．4．甲酰胺．1

5、-B．D．呋哺核糖苷(5-aminoimidazole．4．carboxamide．1．B．d．ribofuranoside，AICAR)干预，westernblotting方法检测AMPK、环腺苷一磷酸反应元件结合蛋白调节转录共激活子2(cyclicadenosinemonophosphate-responseelementbindingprotein-regulatedtranscriptioncoactivator2，CRTC2)蛋白及其磷酸化水平的表达，PCR方法检测过氧化物酶体增殖物激活受体7共激活因子la(peroxisomepr

6、oliferator-activatedreceptor-1，coaetivator-10t，PGC—la)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvatecarboxykinase，PEPCK)和葡萄糖．6．磷酸酶(glucose．6-phosphase，G6pase)基因的表达；选择合适的AICAR浓度，Bt2．cAMP组为对照组进行miRNAs芯片检测两组细胞miRNAs谱的差异。2．AMPK相关miRNAs的生物信息学分析：Targetscan网站对芯片结果中变化超过2倍的miRNAs分成上调和下调的两组分别进行靶基因

7、预测，FunDo分析靶基因与疾病的关系。选择在肝脏中表达丰富、AICAR干预后变化显著的miRNA，应用多个靶基因预测网站再次进行靶基因预测，推测其在AMPK对肝糖代谢的调节过程中可能发挥的作用。3．miR-29参与AMPK信号途径对肝糖异生的调节：realtimePCR方法检测AICAR干预后miR．29家族、靶基因p85a和糖异生相关基因PEPCK、G6pase天津医科大学博士学位论文的表达；设计构建miR-29家族模拟物，转染小鼠原代肝细胞，转染成功后，PCR方法检测p85tx和PEPCK、G6pase基因的表达，westernblot

8、ting方法检测p85a蛋白的表达；进一步在禁食14h小鼠及正常进食的对照小鼠肝脏中检测miR．29家族、p85et基因和蛋白的表达，观察不同状态下AMPK对miR