microrna在肝癌早期诊断中的价值及其影响肝癌预后的机理初探

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1、复旦大学博士学位论文MicroRNA在肝癌早期诊断中的价值及其影响肝癌预后的机理初探姓名：於雷申请学位级别：博士专业：外科学指导教师：周俭2012-04-03中文摘要原发性肝癌是世界上第六大常见肿瘤，每年新发的肝癌病例有一半以上发生在我国。目前导致肝癌发病的最主要病因是乙型(HBV)和丙型(HCV)肝炎病毒感染，在我国HBV感染仍是肝癌发病的主因，但目前新的趋势是一些非病毒感染因素例如肥胖、酗酒等所致的肝癌发生率不断提高，尤其在西方国家，这类因素已经成为新增病例逐年增多的主要原因。肝癌起病隐匿，预后差。手术切除和肝移植等被认为是肝癌根治性治疗的手段，但大多数患者在初次

2、诊断时，便已进入肝癌晚期，因而失去了根治性治疗的机会。其中最主要的原因是早期肝癌患者通常无明显症状，或者体积很小，影象学检查较难察觉，而甲胎蛋白(AFP)作为主要的血清标记物，又存在敏感性低的缺点。一些临床指标如肿瘤大小、数目，血管侵犯情况及术前AFP等常与肝癌患者的预后相关，研究表明，生活习惯(吸烟、饮酒和锻炼)、肥胖状态、受教育程度等都可能影响肝癌患者的预后。在肝癌的分子层面进行研究可以深刻理解这些因素如何影响肝癌患者的预后和为肝癌的分子诊断以及术后个体化治疗方案的制定等提供重要的理论依据。microRNA(miRNA)是通常含有22个碱基的短链非编码RNA，通过

3、调控基因表达，可产生包括控制细胞生长、增殖、凋亡、应激等广泛的生物学作用。自本世纪初发现编码miRNA的染色体位置同癌症发生时常发生变异的位置大量重叠后，miRNA与癌症发生、发展的研究开始兴起，目前已有大量的证据证明miRNA在癌症的发生发展中起到了十分重要的作用。同时有研究表明miRNA能抵抗内源性RNA酶的降解从而在血浆中稳定存在。这些重要的研究都提示miRNA可能成为肿瘤诊断的生物标记物和预后干预的靶点。但miRNA由于其调控基因表达的全新模式，使原有的信号转导通路又多了新的一个层次，变得更加复杂。多数miRNA在肿瘤发生发展信号通路中的功能定位尚未明确，在肝

4、癌研究中则更缺乏。结合目前肝癌早期诊断率低和影响肝癌预后的通路中miRNA功能研究不足的现状，本研究通过对正常人群、高危人群(慢性活动性乙肝患者、乙肝后肝硬化患者)、肝癌患者的血浆样本进行芯片分析，筛选出肝癌中差异表达的miRNA，并在独立组中用实时定量PCR进行验证并建立诊断模型，然后用另一个独立组对诊断模型进行验证，找到了一组miRNA联合检测能较好地早期诊断乙肝相关性肝癌。并检测这组miRNA在术前术后的动态变化；另在组织水平观察这组miRNA在癌及癌旁组织中的表达差异及其与患者预后的联系，并结合预后相关的mRNA，初步确定miRNA影响预后的信号通路。博士学位

5、论文MicroRNA在肝癌早期诊断中的价值和影响肝癌预后的机理研究第一部分乙肝相关性肝癌与各对照组间差异表达miRNA的筛选及验证本部分的研究旨在寻找在乙肝相关性肝癌患者(HCC)与对照组健康者、慢性活动性乙肝患者及乙肝后肝硬化患者之间差异表达的血浆miRNA并在另一独立组中进行验证，为组建肝癌早期诊断模型奠定基础。研究材料第一组是自2008年8月到2008年12月间在中山医院体检或就诊的符合实验准入标准的健康人、慢性活动性乙肝患者、乙肝后肝硬化患者及乙肝相关性肝癌患者的血浆样本，共计137例；另一组于2009年1月到2009年2月取自中山医院或上海公共卫生中心，实验

6、设计相同，共计102例。提取血浆miRNA后，使用含有723条人类miRNA探针的安捷伦公司人类miRNA芯片V2(AgilentHumanMiRNAMicroarraykitV2)进行测定，上样量为每个微阵列100微克miRNA。数据标准化后，主要使用非参数方法Mann．Whitney检验分析HCC和healthy、HCC和CHB、HCC和Cirrhosis中miRNA的差异表达。选取差异两倍以上的miRNA，并在新的独立组中(共计样本102例)使用实时定量聚合酶链反应(quantitativereversetranscriptasepolymerasechainr

7、eaction，qRT-PCR)技术对这些候选miRNA进行验证。结果发现：从芯片结果来看，在HCC和healthy两组间差异表达2倍以上，P<0．01，一半以上样本中可检测到的miRNA共有7个；在HCC和CHB两组间差异表达2倍以上，P<10一，一半以上样本中可检测到的miRNA共有7个：在HCC和Cirrhosis两组间差异表达2倍以上，P<10一，一半以上样本中可检测到的miRNA共有2个。因miR．122在HCC对比healthy和HCC对比CHB中均有差异表达，因此最后得到15个差异表达miRNA，分别是miR-101，miR一122，m