大鼠去细胞化肝脏生物支架的制备及成分分析

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1、学校代码10459学号或申请号201212443330密级公开硕士学位论文大鼠去细胞化肝脏生物支架的制备及成分分析作者姓名：吴大帅导师姓名：吴阳教授学科门类：医学专业名称：外科学（普通外科）培养院系：郑州大学第一附属医院完成时间：2015年3月AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterPreparationandCompositionAnalysisofRatDecellularizedLiverBioscaffoldByDashuaiWuSupervisor:Prof.Y

2、angWuDepartmentofHepatobiliaryandPancreaticSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversityMarch，2015学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研宄所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研宄作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：呈大曰期年义月》十曰学位论文使用授权声明本人

3、在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者曰期:>0/纟奇j"•月摘要大鼠去细胞化肝脏生物支架的制备及成分分析研究生：吴大帅导师：吴阳教授

4、郑州大学第一附属医院肝胆胰外科河南郑州450052摘要背景对于各种肝脏疾病导致的终末期肝衰竭，肝移植是目前医学界公认的最具明确疗效的治疗手段。因目前的供体数量远远不能满足肝移植的需求，如何解决供肝问题，成为当今器官移植领域的研究热点。去细胞化肝脏生物支架（DecellularizedLiverBioscaffold，DLB）是目前在组织工程中提出的一个新观点，通过去细胞化实现对肝脏形态结构的三维重建，保留原来肝脏的绝大部分细胞外基质成分，包括胶原及弹性纤维等。构建一个理想的DLB，解决传统生物支架的低免疫原性、仿生性差及机械强度弱等方面的不足，

5、最终将肝脏细胞及内皮细胞等相关细胞材料与DLB材料实现复合，体外构建适合移植的肝脏，实现对病态肝脏的部分或完全替代，将是组织工程及器官移植领域的一个里程碑。目的本实验结合以往去细胞化器官的制备方案，利用自行设计的去细胞化灌注装置通过化学及酶学相结合的方法制备大鼠DLB，并在支架制备完成后对其进行成分分析，为下一步进行种子细胞再植构建人工肝脏提供实验数据。I摘要方法1．成年SD大鼠，雌雄不限，10％水合氯醛腹腔注射麻醉。取腹部纵向切口，上至剑突，下至耻骨联合上缘，仔细分离肝脏与周围组织。于肝下下腔静脉与右肾静脉交汇处，行200U/ml肝素钠溶液全

6、身肝素化处理。显微操作下门静脉置入20G留置针，剪开肝上及肝下下腔静脉，将生理盐水经留置针注入肝脏内，肝脏颜色逐渐变为土黄色时，停止灌注。仔细分离肝脏周围剩余组织，完整取下肝脏。2．将取下的肝脏随机分为对照组与实验组，对照组4％甲醛固定留存，实验组移入去细胞化装置中，首先用配制比例为0.02％胰蛋白酶及0.05％EDTA混合溶液灌注2h，其次用配制比例为4％Triton-X100及0.05％EDTA混合溶液灌注20-24h，然后用1％SDS溶液灌注2h，再用配制比例为0.1％过氧乙酸及4％乙醇混合溶液灌注2h，最后用头孢唑林钠溶液灌注肝脏6h以

7、上，DLB制备完成。3．对照组与实验组均进行固定，常规行HE染色，透射电镜扫描，同时行I型胶原蛋白、CD35、LCA及Vimentin蛋白免疫组化（immunochistochemistry，IHC)分析。结果1．灌注过程中观察到大鼠肝脏颜色由土黄色逐渐变为半透明，肝脏的脉管系统逐渐显现出来。2．HE染色后，对照组可见大量蓝染并密集分布的细胞核及粉红色分布的细胞外基质，胶原纤维之间无明显断裂。DLB内无明显细胞核成分残留，可观察到呈粉红色并密集分布的细胞外基质。3．透射电镜扫描可见对照组细胞结构明显，清晰看到细胞核卵圆形，高尔基体、内质网等细胞

8、器较丰富，DLB经透射电镜扫描未见明显细胞样结构残存，见大量纤维编织成网状结构，排列有序，同时可见到管状样结构等。4．对照组与DLB内的I型胶原蛋白、