农药污染土壤中漆酶基因的高通量筛选与克隆

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1、分类号密级UDC单位代码10733甘肃农业大学硕士学位论文农药污染土壤中漆酶基因的高通量筛选与克隆HighthroughputscreeningandcloningofLaccasegenefragmentsfromthepesticide-contaminatedsoil胡斌斌指导教师丁伟副教授（甘肃农业大学兰州730070）学科专业名称植物学研究方向蛋白质组学论文答辩日期2015年5月31日学位授予日期2015年6月答辩委员会主席刘恒教授评阅人杨颖丽教授柴守玺教授甘肃农业大学2015届硕士学位论文摘要漆酶(EC1．10．3．2)是自然

2、界广泛分布的一种多铜氧化酶，属于蓝色多铜氧化酶家族中的一个成员，它能氧化酚类及衍生物、芳胺类及衍生物、羟酸类及衍生物、甾体激素类、生物色素类及其它非酚类的相关底物等。目前报道，漆酶广泛的存在于细菌中，相比真菌漆酶，细菌漆酶具有不需糖基化、热力学稳定性好，酶活最适pH广泛等更多的优势。从农药污染的土壤中筛选具有热稳定性良好的细菌漆酶，具有很重要的工业价值。本研究从湖北蕲春农药厂的一级好氧池中采集土壤样品，首先提取土壤样品的宏基因组DNA，根据微生物漆酶的保守区设计引物，PCR扩增漆酶基因片段，通过测序分析土壤样品中的漆酶多样性，在测序的10

3、0个阳性克隆子中，有62条不同的漆酶基因序列，证明漆酶多样性较好。进而展开土壤宏基因组Fosmid文库的构建工作。通过建库，共获得6000余个克隆子。从所构建的Fosmid文库中筛选不同的漆酶基因，目前共筛选得到6个漆酶基因（lac2A3、lac2E6、lac13H9、lac13B22、lac15A5、lac15P1），通过SignalP4.1Server软件对6个漆酶的信号肽进行分析，发现漆酶基因lac2A3、lac13H9、lac15A5均分别含有36个，17个，30个氨基酸的信号肽序列。在分别去掉信号肽的情况下，与其它3个没有信号肽

4、的漆酶基因一起分别与载体pET-22b和pET-30a构建重组表达载体，转化大肠杆菌Transseta(DE3)菌株，最后发现仅重组酶Lac13H9可溶性表达，其他均形成包涵体蛋白而没有活性。对漆酶基因lac13H9进行信息分析，其全长为1389bp，编码462个氨基酸，推断其理论分子量为50kDa，用Signalp4.1软件分析，其含有一个17个氨基酸的信号肽，与NCBI蛋白数据库比对结果表明，与来源于Myxococcusstipitatus的多铜氧化酶序列相似性最高为67%，其次与来源于Sorangiumcellulosum的多铜氧化

5、酶序列相似性为61%，表明这是一个新的漆酶基因。将其在大肠杆菌Transseta(DE3)中通过微好氧发酵进行异源表达，并通过Ni柱亲和层析纯化重组酶lac13H9。获得的重组漆酶Lac13H9具有良好的酶学性质，其最适温度为40℃，最适pH为6.0，且具有较好的热稳定性，在50℃下保温90min还有60%的剩余酶活力，同时发现低浓度的Fe2+促进漆酶酶活力，高浓度则抑制酶活力。良好的酶学性质为该酶的应用奠定了基础。关键词：漆酶，土壤宏基因组Fosmid文库，异源表达，酶学性质I甘肃农业大学2015届硕士学位论文AbstractLacca

6、se(laccase,ECl.10.3.2)isamuti-copperoxidasewhichoxidizesphenolicsubstratessuchaspara-phenylenediamine,hydroquinone,polyphenolsandascorbicacidaccompaniedbyreducingO2towater.Itplaysvitalroleinlignindegradationandhumificationprocess.Laccasehasbeenwidelyappliedinvariousareas,

7、mainlyconcentratedinthefollowingaspects:organiccompoundssynthesis,biologicalsensordetection,thedegradationofnonsteroidalanti-inflammatorydrugs,treatmentofindustrialwastewater,biologicalbleachofpulp,foodindustryandthebiologicalenergybattery.Thepesticide-contaminatedsoilsam

8、pleswerecollectedfromaprimaryaerobicpoolinHubeiQiChunpesticideplant.Inordertoanalysisofthedivers