酸性植酸酶产生菌的筛选及其基因克隆

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1、西南农业大学硕士学位论文酸性植酸酶产生菌的筛选及其基因克隆姓名：马丽苹申请学位级别：硕士专业：微生物学指导教师：彭远义2003.5.1西南农业大学硕士研究生论文摘要植酸酶是催化植酸及植酸盐水解成肌醇和无机磷酸盐的一类酶，它能够解除动物植物性饲料中植酸的抗营养作用，提高植物性饲料的营养价值，因而受到国内外广泛关注，尤其是微生物所产生的酸性植酸酶。但微生物野生菌株产酶水平较低，制约了微生物植酸酶在生产上的广泛应用，因此提高植酸酶野生菌株的产酶水平是实现其广泛应用的关键所在。目前，提高野生菌株产酶水平的主要思路是通过基因

2、工程手段克、隆其植酸酶基因，然后在生物反应器中高效表达该植酸酶基因。才g实验的目的旨在从K土壤中筛选出酸性植酸酶高产菌株，并克隆其植酸酶基因，从而为植酸酶的基因工程提供基因材料。；主要实验结果如下：1．用植酸钙选择性平板培养基从土样中筛选出了102株能产透明圈的菌株，经分离纯化后，接入液体发酵培养基，28℃、220r／min发酵5天，在37℃、pH2．5条件下用钒钼酸铵法测定其所产植酸酶的活力，结果显示，酶活较高的有24株，经再次摇瓶复筛后，酶活大于15U／ml且产酶性能稳定的共有7株，其中以‘l矿菌株的酶活最高，

3、可达53．86U／ml，经初步鉴定为黑曲霉，编号为Aspergillus．nigerl。2．用氯化苄法提取了Aspergillus．nigerl44基因组DNA，根据GeneBank中已知的黑曲霉植酸酶基因序列设计出一对特异性引物(上游引物：57ATAGGCATCATGGGCGTCTC37下游引物：57CAGCTAAGCAAAACACTCCGC37)，采用Pyrobest⋯DNApolymerase(高保真DNA聚合酶)，通过PCR方法从Aspergillus．nigerl4“基因组DNA中扩增出了预期的1．5kb

4、左右的特异性产物，将其与pMDl8一TVector连接后，转化E．colff3H5a菌株的感受态细胞，经质粒抽提、酶切鉴定，确认该目的产物已得到成功克隆。3．核苷酸序列分析表明，PCR扩增产物中包含有完整的phyA基因，该基因全长1506bp，其中包含一段长102bp的内含子，该内含子具有真菌植酸酶基因内含子的特征保守序列：Donor序列—-Gn盯Gc，Lariat序YO--GCTGAC及Acceptor序列一CAG。该基因编码467个氨基酸，理论分子量为5l37kDa，其上有13个潜在的N一糖基化位点，N端19个

5、氨基酸为信号肽序列，植酸骑活性位点序列(CRVTFAQVLSRHGARYPTDSKGK)位于氨基酸序列的+71~+93。4．序列比较结果显示，本研究克隆的phyA基因与A．nigerNRRL3135、Aniger5K。57和A．nigerN25的phyA基因的同源性分别是96％、96％和92％，编码的氨基酸序列同源性分别为98．10％、95．70％和97．90％。k～，一关键词：酌啦植酸酶菌株筛选基因克隆。____一—。一’’。-m_，l酸性植酸酶产生菌的筛选及其基因克隆Thescreeningofanacidic

6、phytase—producingstrainandthecloningofitsphytasegeneMaLiping(CollegeofAnimalandVeterinaryScience，SouthwestAgricultureUniversityChongqing4007l6jAbstractPhytaseisakindofenzymeswhichcarlcatalyzethehydrolysisofphytateintomyo—inositolandphosphate．ItCallrelieveanti—

7、nutritionofphytateandimprovethenutritionalvalueofanimalfeedfromplant，thestudyonphytase，especiallyacidicphraseproducedbymicro—organism，ispaidmuchattentionbyscientistsinourcountryandabroard．However．itswideapplicationsinmanufacturearerestrictedbysuchaquestionaslo

8、wphytase—producinglevelofwildstrains，sobeforethewildstrainswhichcanproduceacidicphytasearewidelyused，theirphytaseactivitiesmustbeimprovedbyvariousmeansinwhichusinganefficientexpres