高产耐热性植酸酶酵母基因工程菌的构建和筛选

《高产耐热性植酸酶酵母基因工程菌的构建和筛选》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、中山大学硕士学位论文高产耐热性植酸酶酵母基因工程菌的构建和筛选姓名：付捷申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：王珣章;龙綮新2003.5.28付捷中山大学硕士学位论文高产耐热性植酸酶酵母基因工程菌的构建和筛选付捷中山大学生物医药中心广州510275中文摘要植酸酶(phytase，myo—inositolhexakisphosphatephosphohydrolases)是一种能水解植酸的磷酸酶类。f作为单胃动物的饲料添加剂，它可使植物性饲料中磷的利用率提高60％，粪便中磷排泄量减少40％(Nelson等，1968：U11ah等，1988Hartingsveldt等，1993

2、)，同时还可降低植酸的抗营养作用，增加动物对蛋白Ⅳ质和一些金属离子的吸收能力(付启高，1998；Graf等，1986)。因J地艋饲料中／添加植酸酶对提高畜禽业生产效益及降低植酸磷对环境的污染有重要意义。fAspergillusniger来源的植酸酶已经商品化，但它的的热稳定性不能完全满L足饲料及饲料加工的要求(65—90"C)。从烟曲霉(Aspergillusfumigatus)中分离的植酸酶能够耐受90一lOO。C高温，而且能在较宽的pH范围内降解植酸(Pasamontes等，1997)，因此具有很大的市场潜力。然而，在野生型菌株中，、植酸酶的表达量很低，难以在生产上推广／本研究通过改变

3、基因偏爱密码，人工合成Asperglllusfumigatus植酸酶基因，以巴斯德毕赤(Pichiapastoris)酵母作为生物反应器，高效表达植酸酶基因。／本文参照Pasamontes等人1997年发表的A扣migatus植酸酶基因(rafp)序＼列，对其进行重新设计与改造。在不改变所编码氨基酸的情况下，根据Sharp等对毕赤酵母密码子偏爱性的研究结果(Sharp等，1986)，将rafp基因部分密码子替换为在酵母中高频使用的密码子。并切除5’端26个氨基酸的信号肽编码序列和信号肽内的内含子序列，在序列5’端加上部分酵母表达载体a信号肽编码序列，最后得到rafp全长编码序列，交由大连宝

4、生物工程公司合成并测序。合成基因编码区片段长1320bp，编码一个由439个氨基酸组成的多肽，理论分子量约为48kD，核苷酸与原始基因的同源性为72％。Ppastoris酵母表达载体pPICZah采用hOXl启动子诱导表达外源基因，pGAPZaA用GAP启动子组成型表达外源基因，因此可能引起表达水平的差异。本文将rafp基因片段分别克隆到两套表达载体中，以比较表达植酸酶的酶活及其付捷中山大学硕士学位论文它酶学性质，筛选具有优良酶学性质的高产菌株。将rafp基因片段分别克隆到pPICZaA和pGAPZaA中，得到的重组表达载体pPICZaA-rafp、pGAPZaA—rafp转化野生型酵母菌

5、X33，获得了多株酵母工程菌X33／pPICZaA—rafp、X33／pGAPZaA—rafp。经含高浓度ZeocinTMYPDS平板筛选、工程菌表达及培养上清的酶活测定，最后得到高效表达A：加migatus植酸酶基因的工程菌X33／pPICZaA—rafp5、X33／pGAPZaA—rafplO，酶活分别为7120±8(U／InL)和9350±1l(U／mL)；表达量分别为107．4mg／L和120．3mg／L,分别占上清总蛋白的82。4％、81。3％。从整体水平看，植酸酶基因在GAP启动子下进行的组成型表达，酶活性略高于AOXl启动子下进行的诱导表达。SDS．PAGE结果显示在80kD

6、左右存在一条特异性表达带，经EndoH脱糖基化酶切割后，分子量降为48kD左右，与该基因表达产物的理论分子量大小一致。结合酶活性测定结果说明，植酸酶基因在酵母工程菌X33／pPICZaA—rafp5、X33／pGAPZaA—rafpl0中均得到了表达、有效分泌，而且表达产物还能进行蛋白翻译后的N一糖基化修饰。对表达植酸酶进行热稳定性分析，上清液经90"C高温处理20分钟，酶活可保留81．1％一83．0％；而商品植酸酶在50．55"{2间约失掉初始酶活的50％，经90℃加热后仅保留25％的酶活。A扣migatus植酸酶能在较宽的pH范围内降解植酸，在pH2．5—8．0之间均有酶活力，最适pH

7、为5．5—6．5。膨／为了提高A．fumigatus植酸酶的比活。将其氨基酸序列第27位的GIn(CAA)突变为Leu(CUU)，获得工程菌X33／pGAPZaA—rafp(m)14，酶活为24450+12(U／mL)，是突变前的2．6倍；表达量可达149．8mg／L，占上清总蛋白的78．2％。但耐热性较突变前有所降低，90"C20min温育后，酶活为处理前的62．1％。突变导致在pH6．5左右活性明显增加。而在偏酸性的