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1、甲醇酵母植酸酶的热稳定性摘要:对甲醇酵母发酵生产的植酸酶性质和热稳定性进行了研究。实验结果显示该酶活的最佳pH值为pH5.5,酶液的活性稳定区间为pH5.0-6.0,当酶液中添加10mmolCaCl2时,能明显提高植酸酶的热稳定性,在80e保温15min,其保留酶活可达到原酶液的77.8%。植酸酶液经过多羟基化合物颗粒化处理后,其酶制剂的高温热稳定性比液体酶或普通固体化处理的植酸酶制剂提高50%。关键词:植酸酶;热稳定性;饲料添加剂;颗粒化;多羟基化合物植酸酶(E.C.3.1.3.8phytase)是磷酸酶的一种特殊类型,能够催化植酸(phyta
2、te)水解,放出5-6个磷酸基团[1],终产物为肌醇(inositol)或肌醇磷酸盐。由于植酸酶蛋白氨基酸顺序中含有Arg-His-Gly模体结构,因此属于组氨酸磷酯酶一类[2]。植酸酶广泛存在于微生物、植物或动物组织中[3],但它的作用在不同的组织中各不相同。在植物中,植酸酶主要为种子萌发提供磷以及为植物提供非常重要的生长因子-肌醇[4],此外,植酸盐被水解还能够释放出钾、钙、镁和锌等植物生长所必需的微量元素,肌醇磷酸酯在物质进入细胞的运输系统中也发挥着重要作用,如3-磷酸肌醇在植物运输系统中作为次级信号传递体起信号转导作用[5]。在微生物细胞
3、中,植酸酶能够对磷的缺乏作出反应,以便及时从周围环境植酸中获得磷供细胞使用。植酸酶在动物细胞中的作用现在还比较模糊,但已知有一个类似于植酸酶的酶(MIPP),它能够调整植酸和1,3,4,5,6-五磷酸肌醇的分子活力[6]。由于能够水解植酸,解除植酸对营养物质的螯合作用,有效提高食品和饲料的营养价值,同时能够替代饲料中无机磷添加,降低生产成本,减少环境的磷污染,植酸酶已成为一种重要的饲用酶制剂。饲料在加工过程中,一般都要进行颗粒化,以杀灭饲料中的沙门氏菌,改善饲料成分的结构,便于饲料储运,增加禽畜的采食量和营养吸收效率。然而饲料的制粒过程通常是在高
4、温(85-95e)下蒸汽预热,再经过1-2min的挤压而成。植酸酶作为一种生物活性大分子,对温度、湿度、酸碱度都十分敏感,通常在相对高温下大部分的酶会发生蛋白质变性,导致酶活迅速下降。作为饲料添加剂,有效提高植酸酶的热稳定性具有实际的应用价值和产业化前景。本文对甲醇酵母发酵生产的植酸酶稳定性进行了研究,并用多羟基化合物对其进行颗粒化处理,考察了颗粒酶制剂热稳定性。1材料和方法111甲醇酵母植酸酶实验所用的酶液由江西民星集团公司提供。粗酶液经2500-3000r/min离心除杂,分离纯化和超滤膜浓缩处理。112植酸酶活测定方法酶活测定方法采用目前B
5、ASF公司使用的钒钼磷法[7]。酶活定义为在37e、pH5.5条件下反应30min,催化0.0051mol/L植酸钠水解,每分钟释放1Lmol的无机磷为一个酶活国际单位(IU)。2实验结果与讨论211植酸酶的最适pH值分别取1mL的酶液加入到不同pH值(1.5-8.5)的乙酸-乙酸钠缓冲液中,在37e条件下保温10min,然后测酶活,测定结果如图1所示,从图上可以看出,植酸酶的最适pH值位于pH5.5处,在pH5.0-6.0间有比较高的活力,当pH值低于4.5或高于6.5时,酶活会急剧下降,在pH1.5以下或8.5以上酶活接近为零。畜禽胃液的pH
6、值也是5.5左右,正好与植酸酶的最佳pH值相吻合,有利于第27卷第1期2003年3月南昌大学学报(理科版)JournalofNanchangUniversity(NaturalScience)Vol.27No.1Mar.2003pH图1pH对植酸酶活性的影响植酸酶发挥最大活力。212Ca2+对植酸酶热稳定性的影响取三批5mL酶液试样,分别为原酶液、含10mmolCaCl2酶液和含5mmolCaCl2酶液,将它们放置于80e下进行高温热处理,每批试样的热处理时间为10-60min。达到处理时间后取出试样并迅速冷却至常温,然后测定其酶活。80e下含有
7、不同CaCl2浓度酶液的热稳定性和保留酶活随处理时间的变化,如图2所示:t/min图2高温热处理时间对植酸酶活性的影响从图2可以看出,原酶液在80e高温下不稳定,前20min内,酶活随时间的增加成直线下降,当处理时间大于20min时,其相对酶活都低于5%,残留酶活极低。可见,液体植酸酶高温不稳定,不适合在饲料制粒中直接添加,必要进行适当的热稳定性保护处理。当液体酶中加入Ca2+后,在处理的前20min内,其耐热性明显提高,但提高的程度有所差异。当处理10min时,加入10mmolCaCl2的酶液和加入5mmolCaCl2的酶液的保留相对酶活差异不
8、大,皆为80%左右,当处理时间为20min时,二者差异较大,加入10mmolCaCl2的酶液的相对酶活为70.1%,仍具有较高的活力,而
