白腐菌漆酶基因的克隆及序列分析

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1、摘要漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，普遍存在于白腐菌中，具有降解木质素和使苯氧基类除草剂等有毒酚类物质无毒化的作用，还可去除石油工业废水的毒性。在造纸、饮料加工、和环保等方面具有广泛的应用自H景。大多数白瘸菌在水中的生长速度较馒，结球结块，仅能生活在水体表面，这些都限制了其在处理废水等方面的直接应用。克隆自腐菌漆酶的结构基因，对今后培育白腐菌漆酶基因大量表达的工程菌株和用工程菌处理酚类污染的废水等具有十分重要的意义。本研究以25种自腐真菌为材料，测定了不同菌株漆酶的活性，并对6种自腐菌漆酶基因进行了克隆和序列分析，结果如下；(I)对25种白腐真菌进行了漆酶活性铡定，结果有11个菌种

2、具漆酶活性，它们分别是裂蹄木层孔菌(Phe]]inus』inteus)、朱红密孔菌(Pycnoporuscinnabarinus)、环带干酪菌(Tvro墨Yceszonatulus)、栎迷孔菌(Oaedaleaquercina)、三色革裥菌(Lenzitestricdor)、北方梭囊孔菌(口imacocystisborealis)、桦革裥菌(Lenzi￡Ps5etu]ina)、血红密孔菌(Pvcnoporussanguineus)、自粑齿菌(Irpexlactea)、单色下皮黑(国r阳月aunicoior)、梭孔菌(FavoiusaJveo]龇‘拈)。(2)建立了快速提取高纯度

3、完整丝状真菌RNA、DNA的方法。(3)通过RT—PCR实验证明了扁芝菌的mRNA不具有Poly(A)序列。(4)设计并合成了用于克隆漆酶基因的一对简并引物，在6个菌种中扩增和克隆了与漆酶基因及其类似基因有同源性的特异片段，它们分别是朱红密孔菌(1227bp)、血红密孔菌(1227bD，AY331189)、单色下皮黑(1207bp，AY454305)、环带干酪菌(1223bptAY454306)、北方梭囊孔菌(1201bp，AY333124)、枥迷孔菌<1232bp，AY333125)。片段的获得为这些菌种全长漆酶基因的克隆奠定了基础。(5)获得了血红密孔菌漆酶基因全长cmA序

4、列。根据已克隆得到的血红密孔萄漆酶基因片段(AY331189)，通过RACE技术从血红密孔菌中扩增得至嘲￡酶全长cDNA序列(AY458017)，共1902bp，包括完整的开放读码框(1554bp)，编码518个氨基酸。其57非编码区为5Ibp，37非编码区为297bp。其编码的氨基酸序列与朱红密孔菌漆酶(1cc3Z)的同源性为96％，与其它担子菌漆酶的同源性也很高。蛋白质结构域预测结果表明在该基因的氮基酸序列中具有4个的铜离子结合区域，7个潜在的糖基化位点，其相对分子量为56313．2，等电点为5．59。(6)获得了血红密孔菌漆酶基因完整DNA序列。根据血红密孔菌漆酶cDNA

5、序列，设计～对特异性引物，经PCR扩增得到了该酶全长的DNA序列(AY510604)，长2154bp，该序列除包含全部血红密孔菌漆酶cDNA编码区外，还包括IO个内含子序列，长度在j2～未经侉轰、、导娜礴jL勿全文公布70bp之间，是典型的真核生物内含子，包括明显的57端的供体剪切位点、3，端的受体剪切位点和分支点序列。关键词：漆酶，白腐菌，血红密孔菌，基因克隆，RACEAbstractLaccasesisakindofCu—comainedpolypbenoloxidaseproducedbymanywhite-rot6m蕾．ItCalldegradeligninandphe

6、noxycontair6ngherbicideandwastewaterinpetroleumindustryandaffecttoxicphenolicmaterials，SOlaccasescanbewidelyappliedinpapermakingindusW、drinkingprocessingandenvironmentprotection、Mostofwhite—rotfungipropagaleslowlyinwaterandagglomeratequickly，SOtheycanonlyliveOnthesurfaceofwater，thesecharacte

7、risticdirectlyrestricttheirappliedforwastewatertreatment．Researchonthecloninglaceasestructuregeneofwhite’rotfungihasaIlimportantsi蛳ficanceforcultivmeengineeringbacilIi，whichexpresshigh[accaseactivityandtreatwastewatercontainingphenolicmaterialsbyth