产毒多杀性巴氏杆菌毒素的不同重组片段的免疫原性比较

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1、论文编号：82110-2012-04中国兽医药品监察所硕士学位论文产毒多杀性巴氏杆菌毒素的不同重组片段的免疫原性比较ComparisonoftheImmunogenicityofRecombinantFragmentsofToxigenicPasteurellaMultocidaToxin研究生：王猛指导教师：蒋玉文研究员申请学位类别：农学硕士学科专业：预防兽医学研究方向：兽医微生物与免疫学学位授予单位：中国兽医药品监察所2015年5月独创性声明本人郑敢声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行

2、研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容，也不包含为获得中国兽医药品监察所或其它教育机构的孕位或证书而使爪过的材料。对木论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。学位论文作者签名：i&K年6月丨7曰关于论文使用授权旳说明木人完全了解中国兽医药品监察所有乂保留、使用学位论文的规定，即：中监所有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，

3、可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国兽医药品监察所可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内谷。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议）研究生签名：L时间:us年6月丨"/円导师签名：时间:年円中国兽医药品监察所硕士学位论文摘要摘要+产毒多杀性巴氏杆菌(toxigenicPasteurellamultocida,TPm)是引起猪进行性萎缩性鼻炎(progressiveatrophicrhinitis,PAR)的主要致病菌。该病是以面部变形、鼻部扭曲、鼻衄为主要特

4、征的呼吸道传染病，流行十分广泛。病猪生长缓慢，饲料利用率降低，给养猪业造成巨大经济+损失。疫苗免疫是预防和控制该病的主要有效措施。TPm分泌的皮肤坏死毒素（Pasteurellamultocidatoxin，PMT）是引起PAR最主要的致病因子。PMT是一个弱免疫原，但当其自然结构被破坏后，其免疫原性会增强。部分截短PMT片段被预测为很好的抗原。+本研究根据GenBank中已发表的PMT基因（toxA）序列，设计引物，以TPmHN-06株基因组DNA为模板，经PCR扩增获得PMT完整基因，并成功构建克

5、隆质粒pMD18-T-PMT。根据DNAStar软件预测分析获得的PMT亲水性基团分布的生物信息，结合相关的研究报道，选取8个不同PMT截短片段作为免疫原性研究的对象。以质粒pMD18-T-PMT为模板，经PCR扩增获得8个截短PMT片段基因，并分别克隆至原核表达载体pET-32a（+）系统中。PCR鉴定、双酶切鉴定和序列测定结果表明，8个重组PMT片段表达载体均构建成功。以IPTG为诱导剂，分别对8个重组表达菌进行诱导表达。SDS-PAGE结果表明，8个重组PMT片段均成功获得表达，且以包涵体形式表

6、达为主。Western-blotting结果表明，仅重组PMT1-506aa、PMT1-391aa、PMT505-1285aa和PMT973-1285aa片段与PMT抗血清有明显的反应原性。小鼠毒性试验表明，该4个重组PMT片段均不致死小鼠。对反应原性较好的3个PMT片段进行条件优化，以提高其表达量。将PMT1-506aa、PMT1-391aa、PMT505-1285aa和PMT973-1285aa4个重组PMT片段分别制备疫苗，皮下注射免疫小鼠，间隔14d进行二免。二免后14d，用天然PMT进行皮下

7、注射攻毒。结果以2MLD进行攻毒时，PMT1-506aa（10/10）、PMT505-1285aa（10/10）和PMT973-1285aa（8/10）免疫保护效果显著优于PMT1-391aa（1/10）；以5MLD进行攻毒时，PMT1-506aa（10/10）和PMT505-1285aa（10/10）免疫保护效果显著优于PMT973-1285aa（3/10）和PMT1-391aa（0/10）；进一步以10MLD进行攻毒时，PMT505-1285aa（10/10）免疫保护效果显著优于PMT1-506a

8、a（3/10）。小鼠的免疫保护试验结果表明，4个重组PMT片段中PMT505-1285aa具有较高的免疫保护率。选取重组PMT505-1285aa片段制备疫苗，肌肉注射免疫断奶仔猪，间隔14d进行二免。二免++10后14d，根据建立的仔猪感染TPm模型，进行TPmHN-06株新鲜菌液（2×10CFU）滴鼻攻毒，30d后剖检观察鼻甲骨病变，结果对照组5/5发生鼻甲骨萎缩，免疫组4/5正常，表明该疫苗对仔猪具有免疫保护作用。同时，应用建立的iELISA方法，