丹参不同提取部位保护高糖损伤内皮祖细胞的活性及质量控制研究

《丹参不同提取部位保护高糖损伤内皮祖细胞的活性及质量控制研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、分类号：单位代码：１０４４１：密级：学号２０１２０２０３１＾＾．．，警二？山《中ｇ爲义ｆＩ．’＇．麵＇，ｒｖｊ＾ｌ统招硕±化乂ｔ中文题目：丹参不同提取部位保护高糖损伤内皮祖细胞的活性及廣量控制研究文题＠：Ｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ盡备ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｒｏｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓｉｍａｉｒｅｄｂ．ｉｐｇｐｙ＾聚ｈｃｏｎｃｅｎ－ｔｒａｉｏｎｏＧｌｕｃｏｓｅａｎｄｔｈｅｈｉｇｔｆ

2、Ｄ９ｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｐａｒｔｓｌｉｒ＾申请人姓名ｆＬ胃入学年月２０１２年９月学科专业药物化学指导教师周洪雷教授学位类型医学科学学位２０１５年６月２日原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立完成的，文中除注明引用的内容外，不包含任何其他己经发表的科研成果。对本文研究做出重要贡献者，均已在文中明确方式表明。本声明的法律责任完全由自己承担。＾广论文作者篇名导师答名

3、关于学位论文使用授权的声明本人完全了解山东中医药大学有关保留使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部口机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。本人授权山东中医药大学可レッ将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。（保密论文在解密后应遵守此规定）论义作者答名日期如小斋么马啼、摘要目的：本论文通过对丹参不同提取部保护高浓度葡萄糖损伤的内皮祖细胞的活性部位进行筛选，并探讨活性部位的保护作用与NO/eNOS信号通路间

4、的关系，同时对活性组分进行了质量控制研究，以期为以后丹参制药工艺的改进以及临床疗效的提高提供实验基础。方法：取丹参药材粗粉，用6倍量90%的乙醇进行回流提取，得到丹参的乙醇总提取液，再浓缩至1.5g生药/ml，再分别用pet、CHCl3、CH2COOCH2CH3、BuOH及H2O进行萃取。最后，将药物残渣加7倍量的水煎煮。减压回收各萃取部位的溶剂，真空干燥，得pet、CHCl3、CH2COOCH2CH3、BuOH、H2O部位及药渣水煎液部位。细胞模型的建立：将诱导培养的内皮祖细胞培养于含60mmol·L-1葡萄糖溶液

5、的M199培养液中，建立模型细胞。将体外培养的内皮祖细胞分为正常组、高浓度葡萄糖损伤组、渗透压对照组以及各部位丹参提取物组，其中正常组细胞：培养液含有5.5mmol·L-1的葡萄糖(D-glucose)；模型组细胞：培养液含有60mmol·L-1的葡萄糖(D-glucose)；渗透压对照组：培养液中含有5.5mmol·L-1的葡萄糖(D-glucose)和55.5mmol·L-1的甘露醇(D-mannitol)。利用MTT法筛选出受试药物对内皮祖细胞增殖能力的影响，以确定最佳受试药物活性部位及其作用浓度。采用酶联免疫

6、（ELISA）法对各组内皮祖细胞中的NO、eNOS的含量进行检测；采用免疫荧光标记检测细胞内eNOS和p-eNOS的分布情况。对保护高浓度葡萄糖损伤的内皮祖细胞活性最佳部位中的有效成分进行薄层色谱鉴别、并且利用高效液相（HPLC）对SM3及SM6部位进行定量鉴别并建立SM3及SM6的指纹图谱。结果：MTT实验结果表明，乙酸乙酯部位(SM3)对高浓度葡萄糖损伤的内皮祖细胞的在所有6各组分中保护作用最佳。此外，药渣水煎液部位(SM6)亦表现出较好的活性作用，且这两个活性两部位的最低有效浓度均是10μg·mL-1。ELIS

7、A试剂盒测试结果表明，相比于高浓度葡萄糖处理后的内皮祖细胞中NO以及eNOS的含量显著降低(p均＜0.05)，经丹参活性组分(SM3和SM6)处理后，细胞中NO以及eNOS的含量相比于高糖处理组得到了显著地升高(p均＜0.05)。免疫荧光结果表明：eNOS蛋白在各组细胞中的分布情况大致相同，主要是集中分布在细胞膜上以及细胞质中，各组相比并无显著差异。p-eNOS蛋白在各组细胞中的分布情况有所差异，正常组中p-eNOS蛋白的表达既出现在细胞膜上，同时也出现在细胞核中，经高糖损伤后，包括高糖损伤模型组以及SM3和SM6组

8、分处理组，p-eNOS主要分布在细胞核中。对SM3及SM6进行了薄层色谱鉴别，并分别对10批SM3和SM6部位进行了定量分析，同时分别建立了指纹图谱，结果表明SM3和SM6部位中均检测到丹参素钠和丹酚酸B两种有效物质，并得出丹参素钠在10批丹参乙酸乙酯部位(SM3)中的平均含量（每1mg提取物中所含的质量）为9.283μg·mg-1；在药渣水煎