中国甘薯双生病毒种类鉴定、分子变异及检测方法研究

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1、分类号：单位代码：密级：非密学号：§博士学位论文中国甘薯双生病毒种类鉴定、分子变异及检测方法研究研究生刘起丽指导教师李健强教授合作指导教师申请学位门类级别农学博士专业名称植物病理学研究方向：种子病理与杀菌剂药理学所在学院农学与生物技术学院年月Ph.D.DissertationIdentificationofSpecies,MolecularVariationandDetectionMethodsofSweepovirusesinChinaPh.D.Candidate:QiliLiuSupervisor:Prof.JianqiangLiDepartmento

2、fPlantPathologyChinaAgriculturalUniversityMay,2015独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中已经注明引用和致谢的内容外，论文中不包含本人和其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：奶时间：年月日关于学位论文使用授权的说明本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定。本人同意中国农业大

3、学有权保存及向国家有关部门和机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人同意中国农业大学将本学位论文的全部或部分内容授权汇编录入《中国博士学位论文全文数据库》或《中国优秀硕士学位论文全文数据库》进行出版，并享受相关权益。保密的学位论文在解密后应遵守此协议）学位论文作者签名：时间：力年月日摘要甘薯是我国重要的粮食作物、食品加工和工业原料及有潜力的能源作物。我国是世界上最大的甘薯生产国。近年来甘薯双生病毒病在我国的发生危害日益加重，严重影响甘薯产业的健康发展。由于我国甘薯双生病毒病一直缺乏系统研究，甘薯双生病毒的种类、分布、分子变异及致病性尚不清楚

4、，导致对这一病害的防控缺乏科学依据。针对上述问题开展了相关研究，取得主要结果如下：中国甘薯双生病毒的种类、发生頻率及分布：利用和方法对采自全国多个省市）的约份甘薯样品进行了双生病毒的检测。共获得个甘薯双生病毒基因组（近）全长序列。我国甘薯双生病毒有个种，包括甘薯曲叶病毒’、甘薯中国曲叶病毒，、甘薯乔治亚曲叶病毒，个种，甘薯上海曲叶病毒（，和甘裏日本曲叶病毒（，个暂定种，以及甘薯中国四川曲叶病毒（、甘薯河南曲叶病毒、甘薯广西曲叶病毒（和甘薯河南曲叶病毒（，个新种。的发生频率最高，达其次为和发生频率分别为和相对较低。甘薯双生病毒在我国三大薯区均有分布，的阳性样

5、品表现出卷叶症状。中国甘薯双生病毒的分子变异：中国甘薯双生病毒个不同分离物的基因组核酸序列相似性在之间。个分离物核酸序列相似性在之间’种内变异最大；￥个分离物的核酸序列相似性在之间，种内变异相对较小。进化树分析显示中国甘薯双生病毒可分为个分支。中国甘薯双生病毒个基因的核酸序列相似性在之间，在进化树上聚为两个大的分支。甘薯双生病毒个新种的全序列及重组分析：获得了个甘薯双生病毒新种的基因组全长序列。基因组全长，与的核酸序列相似性最高（；重组分析发现含有由和重组而来的序列。基因组全长与的核酸序列相似性最高（，其、基因是由与重组而来，非编码区（区）含有和重组而来的

6、序列。基因组全长与核酸序列相似性最高（；它含有由与重组而来的序列。基因组全长与核酸序列相似性最高（，含有由、和重组而来的序列。甘薯双生病毒的检测方法研究：①和基因的原核表达及抗血清制备；在大肠杆菌中高效表达了和的基因，以表达的蛋白为抗原免疫家兔，制备了和两种病毒的特异性抗血清。检测结果表明抗血清的效价为抗血清效价为。两种抗血清均可用于田间甘薯样品的检测。②多重检測方法的建立：通过设计针对、和三种双生病毒的特异性引物，优化多重反应条件，建立了能同时检测这三种甘薯双生病毒的多重方法。该方法能有效区分三种病毒，最低检测拷贝数分别为拷贝、拷贝⋯和拷贝。③基于深度測

7、序技术的甘薯双生病毒栓測方法：首次将深度测序技术应用于甘薯双生病毒的检测，通过提取甘薯样品的总，经、构建文库、高通量测序、数据质量控制、病毒片段拼接比对及验证，共检测到种甘薯双生病毒。侵染性克隆的构建：利用无缝连接技术构建了的侵染性克隆。农杆菌介导法接种病毒周后，本氏烟系统叶出现轻微的皱缩、起泡和黄化症状，利用方法从本氏烟的系统叶中检测到了的存在，初步证明了侵染性克隆的活性。关键词：甘薯双生病毒，种类鉴定，变异，检测方法，侵染性克隆AbstractSweetpotatoisaimportantfoodcrops,foodprocessingandindus

8、trialrawmaterialsandwouldbeaenerg