表达ag85a-il-17a重组耻垢分枝杆菌构建及抗气道炎症反应机制

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1、上海交通大学2012级博士研究生学位论文表达Ag85A-IL-17A重组耻垢分枝杆菌构建及抗气道炎症反应机制作者：陈凌学号：0127259302专业：儿科学指导教师：张建华指导小组：吴良霞郭盛范小勇申请学位：博士研究方向：呼吸系统感染与变态反应性疾病培养单位：上海交通大学附属第六人民医院基金资助：国家自然科学基金（No.81172887）2015年4月DissertationSubmittedtoShanghaiJiaoTongUniversityfortheDegreeofPhilosophyDoctor

2、CONSTRUCTIONOFRECOMBINANTMYCOBACTERIUMSMEGMATISEXPRESSINGAG85A-IL-17AANDITSMECHANISMSAGAINSTAIRWAYINFLAMMATIONPh.D.candidate:LingChenStudentNO.:0127259302Specialty:PediatricsSupervisor:JianhuaZhangSchoolofMedicineShanghaiJiaoTongUniversityApril,2015上海交通大学博

3、士研究生学位论文上海交通大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：2015年5月4日上海交通大学博士研究生学位论文上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门

4、或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密√□。（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：2015年5月4日日期：2015年5月4日上海交通大学博士研究生学位论文表达Ag85A-IL-17A重组耻垢分枝杆菌构建及抗气道炎症反应机制摘要气道炎症反应是多种呼吸系统疾病的共同病理特征，主要包括感染性

5、气道炎症反应和过敏性气道炎症反应。肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae）是呼吸系统最常见的感染病原体，其感染后气道炎症反应以中性粒细胞浸润为主。哮喘则是以气道炎性细胞浸润、气道高反应性和气道黏液分泌增加等为特征的过敏性疾病，中性粒细胞在其病理过程中也发挥重要作用。目前研究发现，Th17细胞及其分泌的细胞因子IL-17A、IL-17F等在以中性粒细胞浸润为特征的气道炎症反应中发挥关键作用。因此，拮抗IL-17A和IL-17F的功能成为抑制气道炎症反应的重要途径。我们对IL-17A和IL-

6、17F与肺炎链球菌感染所致气道炎症反应的关系进行了实验研究，并在此基础上进一步研究IL-17A和IL-17F与过敏性气道炎症反应的相互关系。根据LanreDelavallée的理论，当自身蛋白与外源性蛋白结合，通过外源性蛋白提供Th细胞抗原表位，可激活T-B细胞反应，活化B细胞，产生抗自身蛋白的抗体。因此，我们设想若在体内诱导产生抗IL-17A和IL-17F的自身抗体，抑制IL-17A和IL-17F的功能，可望有效减轻气道炎症反应。耻垢分枝杆菌（Mycobacteriumsmegmatis）无致病性，且具有

7、免疫调节功能，是基因工程疫苗的常用载体。Ag85A是卡介苗（BCG）免疫原性较强的分泌蛋白复合体Ag85的组分之一，能够促进Th1型免疫反应。本实验拟构建重组耻垢分枝杆菌疫苗，以Ag85A为外源性蛋白提供Th细胞抗原表位，在小鼠体内诱导产生抗IL-17A和IL-17F自身抗体，研究其抗气道炎症反应的相关机制。目的：构建表达Ag85A-IL-17A/F重组耻垢分枝杆菌rMS-Ag85a-IL-17a/f，体内诱导产生抗IL-17A和IL-17F自身抗体，并探讨其抗气道炎症反应相关机制。方法：本实验拟分三步进行

8、：（1）rMS-Ag85a-IL-17a/f的构建及体内诱导自身抗体产生：利用分子克隆技术，将Ag85a-IL-17a/f基因片段克隆至穿梭表达载体pMFA42S中，构建获得重组质粒pMFA42S-Ag85a-IL-17a/f，并电转化至耻垢分枝杆菌中，获得rMS-Ag85a-IL-17a/f。经Westernblot鉴定蛋白表达。以重组耻I上海交通大学博士研究生学位论文垢分枝杆菌鼻腔黏膜免疫小鼠，ELISA法检