hsv--2抗原表位重组耻垢分枝杆菌的构建和免疫效果观察

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1、分类号：学号：2010003螋幽必必泰山匿亏院硕士学位论文论文题目：HSV-2抗原表位重组耻垢分枝杆菌的构建和免疫效果观察作者姓名：陈国敏学科、专业：病原生物学学位类型：科学学位型研究方向：临床微生物学与微生物学检验指导教师：于爱莲教授入学时间：2010月9月论文工作起止时间：2011年10月-2013年5月中文摘要英文摘要符号说明⋯⋯⋯⋯⋯目录⋯⋯⋯3⋯⋯⋯5前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1／刖百⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯第一部分⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．13构建nsv-29nD重组MC2155⋯⋯⋯⋯⋯材料与方法结果讨论第二部分⋯重组MCzl55的初步免疫效果观察材料与方法结果讨论13142428⋯⋯⋯⋯30结论⋯⋯⋯⋯。参考文献综述⋯⋯．36⋯⋯．41⋯⋯48墅I【谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··55攻读学位期问发表的学术论文⋯⋯⋯原创性声明HSV-2抗原表位重组耻垢分枝杆

3、菌的构建和免疫效果观察研究生：陈国敏姗专业：病原生物学～导师：于爱莲教授王玉副教授中文摘要目的构建2型单纯疱疹病毒载体疫苗，检测重组载体疫苗的免疫效果，为获得预防和治疗2型单纯疱疹病毒慢性感染的重组载体疫苗奠定理论基础，为2型单纯疱疹病毒疫苗的研制提供一种新的策略。完善耻垢分枝杆菌载体疫苗构建技术，为其作为病毒疫苗制备平台提供技术支持。方法1、pmv261．gaD-s70质粒的构建查阅文献，根据GeneBank中登记的nSV-29D和gB的基因序列构建gBD一570，将含有EcorI和salI酶切位点的gBD一5

4、70亚克隆入载体puc57，经鉴定正确后，同时酶切穿梭质粒PMV-261和pue57-gBD一570，并将酶切片段gBD一570回收后亚克隆入酶切后的穿梭质粒PMV-261中，构建重组质粒pmv-gBD一570，经提质粒，酶切和菌落PCR鉴定正确后提取重组质粒，一20"C保存备用。．2、目的基因gBD．570的蛋白表达将提取的质粒通过电穿孔亚克隆入耻垢分枝杆菌(MC2155)，用SDS-PAGE方法鉴定gBD一570的表达。3．免疫动物6周龄的雌性BALB／c小鼠随机分为6组(每组10只)，于小鼠双侧股四头肌注射

5、免疫，各组依次为：1组，每侧各注射NS(生理盐水)200gl；2组，每侧各注射空载体质粒PMV261200gl(1mg／m1)；3组，每侧各注射lxl06efu／ml的MC2155200pl(1mg／m1)；4组，注射低浓度(1x104efu／m1)的重组MC2155200m；5组，注射中浓度(1x106cfu／m1)组的重组MC2155200gl；6组，高浓度(1x108efu／m1)组的重组MC21552009l。免疫完成三周后，于小鼠断尾采血，间接ELISA法检测血清IgG、IFN-),及IL一2表达量，并

6、通过MTT法对小鼠的脾淋巴细胞增值率进行检测结果1、构建重组质粒PMV-gBD一570转化大肠杆菌DH5a，经菌落PCR、双酶切以及测序鉴定正确，质粒构建成功。2、将构建成功的质粒电穿孔转化入耻垢分枝杆菌MS中，经菌落PCR及双酶切鉴定正确，质粒转化成功。3、SDS—PAGE结果显示，重组质粒可以在MS中正确表达4、免疫小鼠后实验结果显示：中浓度组重组MC2155和高浓度组MC2155的免疫效果均优于其他实验组，能够较好的诱导体液免疫及细胞免疫。结论1、成功构建了融合蛋白表达载体PMV261-gBD一5702、重

7、组表达载体在耻垢分枝杆菌中获得了有效表达3、重组耻垢分支杆菌能够较好的诱导小鼠体液免疫和细胞免疫，为下一步的疫苗制备工作奠定了基础。关键词Ⅱ型单纯疱疹病毒；糖蛋白D；糖蛋白B；耻垢分枝杆菌；穿梭质粒PMV261；DNA疫苗2CoNSTRUCTIoNoFHSV-2EPIToPERECoMBINANT姗COBACTERIUMS姗GⅣIATISANDⅡ垣M[I姗EFFECTPostgraduate：ChenGuominMajor：PathogenicBiologyY，uAilianViceprofessorWangYu

8、ABSTRACTObjectiveConstructionofherpessimplexvirustype2vectorvaccine，immuneeffectofdetectionofrecombinantvectorvaccine，forthepreventionandtreatmentoflayatheoreticalfoundationforrecombinant