缝隙连接蛋白磷酸化介导镜像痛敏的时空表达研究

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1、延安大学硕士学位论文缝隙连接蛋白磷酸化介导镜像痛敏的时空表达研究专业名称：细胞生物学作者姓名：杨清湖指导教师：白占涛分类号：Q257学号：12113003单位代码：10719密级：论文题目：缝隙连接蛋白磷酸化介导镜像痛敏的时空表达研究论文作者：杨清湖指导教师、职称：白占涛教授学科、专业名称：细胞生物学提交论文日期：二〇一五年六月创新性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢中所罗列的内容以外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果；也不包含为获得延安大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与

2、我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。本人签名：日期：关于论文使用授权的说明本人完全了解延安大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属延安大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位仍然为延安大学。学校有权保留送交论文的复印件，允许查阅和借阅论文；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。（保密的论文在解密后遵守此规定）本学位论文属于保密在年解密后适用本授权书。本人签名：日期：导师签名：日期：缝

3、隙连接蛋白磷酸化介导镜像痛敏的时空表达研究细胞生物学杨清湖指导老师：白占涛教授摘要：疼痛是当前严重困扰人类健康的生物医学难题之一。疼痛诱发因素多样化，如机体组织损伤、炎症、情绪失控、运动感觉障碍、遗传突变、肿瘤等均可改变痛觉感受、传递、整合的个体自我保护和内在适应的可塑性，所呈现的持续性、慢性化、个性化在多层面制约着临床预防、诊断、治疗策略的有效选择。疼痛表症多样化，如除在躯体损伤部位表现持续自发痛、原发性痛敏和损伤部位周围区域出现继发性痛敏外，在损伤部位同体节的对侧对称部位亦出现所谓“镜像痛敏”。然而，迅猛发展、高潮迭起的疼痛调控研究仍缺乏对诸如镜像痛敏等复杂表症发生、发展和维持

4、机制的系统理解。缝隙连接通道及半通道介导神经与胶质的胞间通讯互作，且具有蛋白亚型、细胞表达分布、磷酸化功能调控的多样性，尤其在疼痛等疾病调控的相关性机制是前沿热点。本论文工作基于蝎毒素多肽类特异性钠通道激活剂——BmKI诱发镜像痛敏动物模型，采用行为药理学、实时荧光定量PCR、免疫组化和免疫印迹等方法探究外周和中枢缝隙连接蛋白亚型及其磷酸化动态调控与镜像痛敏发生、发展和维持的相关分子与细胞机制。主要结果如下：1.脊髓和背根神经节连接蛋白亚型的差异性表达分布采用实时荧光定量PCR方法发现，大鼠脊髓和背根神经节（DRG）中连接蛋白亚型表达分布差异较大。脊髓中主要表达Cx47、Cx45、

5、Cx43、Cx36、Cx32、Cx30、Cx29和Cx26；DRG中主要表达Cx45、Cx43、Cx39、Cx37、Cx36、Cx32、Cx31.1、Cx31、Cx30、Cx29和Cx26。且脊髓和DRG中同一连接蛋白表达丰度存在差异。提示，缝隙连接蛋白的表达和功能调控具细胞表达差异性。2.Connexins以开放和表达量改变参与镜像痛敏的发生、发展和维持预先鞘内注射缝隙连接通道开放抑制剂CBX、GA或Cx43特异拟似肽Gap26均可剂量依赖性显著抑制大鼠单侧后足底皮下注射BmKI诱发的自发痛、长时程双侧机械镜像痛敏。这些行为学证据表明，关闭或抑制缝隙连接通道缓减疼痛发生、发展和维

6、持。进一步的定量检测发现，随疼痛时程的发展变化，脊髓双侧Cx36呈现“n”型，双侧Cx43呈“v”型，同侧Cx32呈“n”，而对侧呈“v”型；DRG中三者均呈现先增后降趋势。因此，脊髓和DRG双侧各连接蛋白亚型表达呈现左右并不完I全相同的“时间窗口”。无论脊髓或DRG，三种Connexins的表达变化趋势均可被缝隙连接通道抑制剂CBX不同程度地逆转。结果表明，缝隙连接蛋白通过开放与关闭的通道功能或表达量的变化参与镜像痛敏发生、发展和维持的调控，而Cx43作用尤为重要。3.Connexins亚型细胞定位分布与镜像痛敏发生、发展和维持在脊髓，Cx32在脊髓背角均匀分布，均与神经元标记蛋

7、白NeuN、星形胶质细胞GFAP和小胶质细胞Iba1具不同程度共标。Cx36则主要分布在脊髓背角深层，与NeuN共定位在一起，少量与GFAP及Iba1共标。Cx43主要与GFAP共标，少量与Iba1共标，与NeuN无共标。随着疼痛发生发展，脊髓背角浅层Cx43与GFAP共标率呈逐渐上升趋势，而深层长时程保持高水平增加状态。在DRG中，Cx43、Cx36和Cx32阳性与NF200均有不同程度共定位；Cx32与IB4阳性神经元共标，与CGRP神经元几乎不共标；Cx43和C