猴头菌原生质体制备及基因组序列的初步分析

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1、分类号：单位代码：１０４４１：密级学号：２０１２０２０６０＾心；｜；ｒ＾山系中（１爲￡葦统招颐±１６交除、Ｉ中誦麵麵体制备及暑補■刺的初步分析‘’＾＾英文题目：ＳｔｕｄｉｅｓｏｎｔｈｅｒｅａｒａｔｉｏｎｏｆｐＨｅｒｉｃｆｕｍｐｅｒｉｎａｃｅｕｓａｎｄａＰｒｅｌｉｍｉｎａｒｙＡｎａｌｙｓｉｓｏｎＧｅｎｏｍｅＳｕｅｎｃｅ．ｑ．，。，，，‘Ｒｌ她申请人姓名张琪入学年月２０１２年９月学科专业生药学指导教师徐凌川教授学位类型医学科学学位Ａ２０巧年６月３日．’．■．？：

2、＇＇？Ｖ＞原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立完成的，文中除注明引用的内容外，不包含任何其他己经发表的科研成果。对本文研究做出重要贡献者。本声明的，均已在文中Ｗ明确方式表明法律责任完全由自己承担。论文作者签名签名法Ｈ日期知心、（＿导师涂关于学位论文使用授巧的声明本人完全了解山东中医药大学有关保留使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部口机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。本人授权山东中医药大学可将本学位论文的全部或手部分段内容编入有关数据库进行检索，可采用影印、缩印或其他复印保存

3、和汇编本学位论文。论文（保密论文在解密后应遵守此规定）作者签名导师签Ａ如日期心广－提要目的：以原生质体再生的单核菌丝为材料测得猴头菌（Hericiumerinaceus(RullexF.)Pers.）的基因组DNA，并对二萜类化合物合成途径中的关酶基因进行挖掘；以猴头菌原生质体为实验材料采用农杆菌介导的遗传转化法（agrobacterium-mediatedtransfermation，ATMT）建立猴头菌的遗传转化体系。方法：原生质体的制备条件优化试验中采用单因素试验法，对三类酶系统、溶壁酶浓度、无机和有机两类稳渗剂、pH、酶解温度、培养基成分以及菌龄的原生质体

4、制备条件进行考察；原生质体再生条件优化试验采用了正交试验和单因素试验结合的方法。正交试验的4种因素分别为：酶浓度、酶解温度、酶解时间及菌龄；单因素试验则考察了渗透压稳定剂种类、浓度及再生培养基种类对再生率的影响；采用二代测序技术平台对猴头菌单核体的全基因组DNA进行了检测，并利用生物信息学手段对其二萜类生物合成途径中的关键基因进行了分析。采用农杆菌介导猴头菌原生质体的方法建立遗传转化体系。结果：原生质体制备的最优条件为：在马铃薯培养基中静置培养72h的猴头菌丝，用2%的溶壁酶液，以0.6mol/LKCl为渗透压稳定剂，在pH5.5、温度30℃的条件下酶解3h，原生质体的释放量最大；

5、原生质体再生的最优条件为：酶浓度为2%、温度35℃、酶解时间2h、菌龄72h，以添加0.6mol/L的甘露醇的马铃薯综合培养基再生的原生质体再生率最高；基因组测序结果为猴头菌基因组大小大于50M、GC%大于40%，猴头菌的GGPPs基因同黄灰青霉菌的亲缘关系较近同其他物种的亲缘关系较远；遗传转化体系建立试验得到拟转化子2个但经实验验证均未稳定整合潮霉素抗性基因。结论：原生质体的制备及再生条件的优化对于猴头菌基因组DNA的测序是至关重要的；采用二代测序的方法可以很好的挖掘猴头菌二萜类化合物生物合成途径中涉及到的酶基因，为其次生代谢调控打下坚实基础；农杆菌介导的遗传转化方法虽然试验过程

6、复杂且不易成功，但是其转化率高、破坏力小，所以该方法适合应用于遗传转化体系的建立。关键词猴头菌；原生质体制备；再生；基因组测序；农杆菌介导的遗传转化StudiesonthepreparationofHericiumerinaceusandaPreliminaryAnalysisonGenomeSquenceSpeciality:PharmacognosyAuthor:ZhangQiTutor:Prof.XuLing-chuanAbstractObjective:TosequencetheWhole-genomesequenceofmonokaryonwhichregenerates

7、fromtheprotoplastofHericiumerinaceus(RullexF.)Pers.,andidentifiythekeygenebygenesanalysisofditerpenoidsbiosynthesis;TrytoestablishagenetictransformationsystembyATMT.Methods:Singlefactorexperimentalmethodhasbeenusedfortheresearchofprepar