家蚕杆状病毒bm64基因功能研究

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1、密级★保密期限：（涉密论文须标注）ZSTUZhejiangSci-TechUniversity硕士学位论文Master’sThesis中文论文题目:家蚕杆状病毒bm64基因功能研究英文论文题目：Functionalstudyonbm64genefromBombyxmoriNucleopolyhedrovirus学科专业:生物化学与分子生物学作者姓名：潘慧慧指导教师:张耀洲教授全滟平副教授递交日期:2015年1月9日浙江理工大学学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他

2、人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得浙江理工大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：_雙重签字曰期：>戊年3月丨丨曰学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解浙江理工大学有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权浙江理工大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以釆用影印、缩印成扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者鮮：%%%签字日期：年i月/

3、

4、日导师签名：签字曰期:Y…年；^月乂曰本研究由国家高技术研究发展计划“863”项目（No.2011AA100603）提供资助浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒bm64基因功能研究摘要家蚕核型多角体病毒（BombyxmoriNucleopolyhedrovirus,BmNPV）属于杆状病毒科核型多角体病毒属。家蚕核型多角体病毒（以下简称家蚕杆状病毒）是感染家蚕的重要病原体，我国家蚕养殖业每年因此遭受巨大经济损失。对于家蚕杆状病毒基因功能的探索是近些年来研究热点之一，但是依然存在很多功能未知的基因。本研究就家蚕杆状病毒的功能未知基因bm64开展研究。通过对NCBI上发布

5、的BmNPV（T3株）全序列（GenBankNo.L33180.1），进行生物信息学分析，寻找bm64基因序列并进行比对和结构域预测。结果表明bm64与AcMNPV同源序列的同源性高达95%，Bm64蛋白含有一段疏水结构域（62~84aa）。通过构建pGEX-4T-3-bm64，转化至Rosetta菌株，诱导表达Bm64蛋白，亲和纯化该蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔，获得多克隆抗体。使用该抗体成功检测到BmNPV感染BmN细胞后产生Bm64蛋白。通过间接免疫荧光检测发现BmNPV感染细胞后Bm64蛋白主要定位于细胞核内。因此，推测bm64基因可能在病毒DNA复制和转录过

6、程中起一定的作用。通过实时定量PCR对该基因的转录时相进行检测，发现bm64基因的转录时相与晚期基因vp39相似，推测该基因为晚期基因。为阐明bm64基因功能，利用Red同源重组系统和Bacmid杆粒构建bm64缺失型重组杆状病毒，探索其基因缺失对病毒复制的影响。通过Bac-to-Bac系统将bm64基因及其启动子进行异位补回，构建基因回复的重组杆粒。将egfp与ph基因通过Bac-to-Bac系统重组入Bacmid中，构建三种不同Bacmid（Bacmid-egfp-ph、Bacmid-⊿bm64-egfp-ph、Bacmid-bm64rep-egfp-ph）。We

7、sternBlot验证基因缺失重组病毒不表达Bm64蛋白。将三种杆粒转染细胞，发现bm64基因缺失后重组病毒导致细胞病变的时间明显延迟，而TCID50检测也表明病毒滴度下降，而基因补回的重组病毒感染细胞后的病毒滴度达到野生病毒水平。因而，推测bm64基因是病毒复制的非必需基因，但是bm64基因在病毒复制感染中起重要作用。Real-timePCR检测显示bm64缺失的重组杆状病毒的早、晚、极晚期基因lef-3、vp39、p10转录水平均有不同程度的降低。I浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒bm64基因功能研究本研究对bm64基因的转录时相、原核表达和亚细胞定位等方面进

8、行研究，通过对基因缺失的重组杆状病毒进行病毒滴度、病毒DNA复制、转录及蛋白表达检测，推测bm64基因能影响病毒复制，是病毒复制的非必需基因，其确切机制有待深入研究。关键词：家蚕杆状病毒；bm64基因；基因功能；II浙江理工大学硕士学位论文家蚕杆状病毒bm64基因功能研究AbstractBombyxmorinucleopolyhedrovirus(BmNPV)belongstothegeneraofNucleopolyhedrovirusinthefamilyofBaculoviridae.BmNPVisanimportantpathgontosil