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时间:2019-02-17
《家蚕杆状病毒表达的hgm-csf的纯化及糖基化分析》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、南开大学硕士学位论文家蚕杆状病毒表达的hGM--CSF的纯化及糖基化分析姓名:田静秒申请学位级别:硕士专业:药物化学指导教师:张耀洲2012-05摘要hGM.CSF是一种重要的造血调控因子,能诱导粒细胞前体和巨噬细胞前体细胞呈集落性生长,在促进粒细胞恢复方面疗效显著,具有重要的临床应用价值。由于糖基化程度和派生细胞类型的不同,重组细胞能产生多种形式、大小不同的hGM.CSF,其分子量变化从16.50kDa。糖基化可影响hGM.CSF的药代动力学性质,抗原性和毒性,对于延长血清半衰期有很重要的作用,糖基
2、化程度高的动物细胞源的rhGM—CSF在体内稳定性方面优于酵母和大肠杆菌源的,因此纯化家蚕杆状病毒表达的hGM.CSF以及分析其糖基化有一定的研究意义。本研究首先对接种hGM—CSF的蚕蛹粉进行了Westernblot鉴定,在PVDF膜上能杂交到特异性条带,通过夹心法ELISA检测到蚕蛹粉中hGM.CSF蛋白的含量为2%o左右。而后开展了小规模纯化预实验,蚕蛹粉中含有大量的杂质及油脂,因此采用高速离心、硫酸铵分级沉淀和超滤对蚕蛹粉进行粗纯化,通过ResourceQ阴离子交换色谱能使目的蛋白得到富集,进
3、行免疫共沉淀进一步纯化目的蛋白,得到了微量较纯的hGM.CSF。家蚕杆状病毒表达的hGM.CSF不带His、GST等标签,只能采用离子交换色谱、亲和层析、分子排阻色谱等方法来达到纯化的目的,而采用亲和层析方法进行大规模纯化需要大量的抗体,因此在进行小规模纯化实验的同时,免疫新西兰雄兔制各了hGM.CSF多克隆抗体,获得了大量多克隆抗血清,并将抗体用亲和层析柱纯化,为接下来的大规模纯化实验奠定了基础。大规模实验通过高速离心、硫酸铵分级沉淀和超滤对蚕蛹粉进行粗纯化,采用DEAE阴离子交换色谱和抗体亲和层析
4、柱进一步纯化,获得了一定量(2mg)较纯的hGM.CSF,而通过这些方法的纯化,hGM—CSF的含量也由最初的2.30%。上升到了204.50%0。利用N型糖苷酶PNGaseF和EndoH对较纯的hGM.CSF进行了酶切去糖基化分析,去糖基化后的hGM—CSF在SDS.PAGE和Westernblot上显示比去糖基化前小1.2kDa,说明hGM.CSF蛋白有N型糖苷链修饰,而去糖基化后比预期的分子量还要大,可能存在潜在的0.糖基化。挖点对去糖基化前后的蛋白进行质谱检测,质谱鉴定结果为hGM.CSF蛋白
5、,SequenceCoverage达到43%。关键词:hGM.CSF,纯化,糖基化AbstracthGM—CSFisakindofimportantinducegranulocyteandmacrophagefactorofhematopoiesisregulation,whichcanprecursorcellsincolonygrowthandhasapparentcurativeeffectonthepromotionofgranulocyterecovery,thusithas1mportan
6、tvalueinclinicalapplication.RecombinantcellswerefoundtoDroducehGM-CSFinmultipleformsofvaryingsize,from16to50kDa,dependingupontheextentofglycosylationandthetypeofcellfromwhichitisderived.GIVcosylationmaYaffectthepharmakokinetics,antigenecityandtoxicityof
7、hGM.CSF,anditplaysan1mportantroleinextendinghalf-lifeoftheserum.TheinvivostabilitVofheavilvglycosylatedanimalcell-derivedrhGM—CSFissuperiortothatoftheyeastandEscherichiacoli-derivedforms.SoitmakessensetopurifyhGM—CSFexpressedbvsilkwormbaculovirusandtoan
8、alyzeitsglycosylation.Inthisstudy,firstlysilkwormpupapowderinoculatedwithhGM.CSFvimswasidentifiedbyWesternblotthatspecificbandswasdetectedonthePVDFmembralle.ThelevelofhGM-CSFproteininsilkwormpupapowderwasabout2%。detectedbvsandwic
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