抗菌肽dermaseptin+s4在杆状病毒表达系统中的表达和纯化

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1、兰州大学硕士学位论文抗菌肽DermaseptinS4在杆状病毒表达系统中的表达与纯化摘要目的：利用BaC-to—Bac杆状病毒表达系统表达抗菌肽DermaseptinS46串联体，并对其进行纯化和鉴定。为进一步研究抗菌肽DermaseptinS4结构与功能的关系奠定基础。方法：1．根据抗菌肽DermaseptinS4的氨基酸序列及真核生物偏爱密码子，推出DermaseptinS4编码基因的序列，并将DermaseptinS4基因通过连接肽(GATAGGTAGCG)将六个基因片段连接在一起，形成DerrnaseptinS46串联体基因，并在六串

2、联体的两侧分别加上了Xbal和SalI的限制酶切位点，设计出目的基因，并通过化学合成方法将DermaseptinS46串联体基因合成。2．将抗菌肽基因DermaseptinS4六串联体克隆到BAC—TO．BACTM重组杆状病毒表达系统的pFASTBacl载体中，构建了重组转座载体pFASTBac．6DermaseptinS4，抽提重组质粒测序鉴定。3．将鉴定正确的重组质粒转化到DHlOBac大肠杆菌感受态细胞，经蓝白筛选，挑取阳性重组菌落，抽提重组质粒以通用引物RV作为引物进行PCR鉴定。4。获得重组成功的BacmidDNA，并转染昆虫草地夜

3、蛾(Bombyxmandafina)St9细胞出现病变后，收集含有重组病毒颗粒的培养上清，重新感染草地夜蛾SD单层细胞，收集SD细胞培养上清和细胞再进行SDS—PAGE及Westernblot5．用ProBondTM纯化系统(Invitrogen公司产品)采用非变性条件对抗菌肽DermaseptinS4蛋白进行纯化。结果：1．重组表达质粒经双酶切、PCR及测序鉴定。证明成功构建了pFASTBac．6DermaseptinS4质粒。2．12％聚丙烯酰胺凝胶电泳可见表达的目的蛋白带，分子量大小为27000，与理论值相符，灰度扫描显示，表达量约占细

4、胞总蛋白的20．1％．Westernblot显示目的蛋白均具有良好的反应原性。兰州大学硕七学位论文结论：成毒表达系构与功能关键词：功构建了抗菌肽统得到成功表达的关系奠定基础DermaseptinS46串联体，并在昆虫细胞中经杆状病并进一步对目的蛋白进行了纯化，为下一步蛋白结DermaseptinS46串联体；杆状病毒表达系统；基因表达；蛋白纯化ExpressionandPurificationofAntimicrobialPeptideDermaseptinS4GeneinBaculovirusExpressionSystemObjectiv

5、e：WeexpressandpurifytheantimicrobialpeptideDermaseptinS4(DS4)inBac-to—Bacbaculovirusexpressionsystem．ItlayedthefoundationinordertostudythestructureandfunctionofantimicrobiaIpeptidesDermaseptinS4Methods：1．AccordingtoaminoacidsequencesofantimicrobialpeptidesDermaseptinS4andeu

6、karyoticpreferredcodonsgenessequence．WEinductedthegenesofDermaseptinS4．andweconnected6DermaseptinS4with5connectingpeptides．2．thefragmentwasclonedintothepFASTBaclvectorofBAC-TO-BACrecombinantbaculovirusexpressionsystemtoconstructarecombinantexpressionvector．3．TheplasmidpFAST

7、Bac—DermaseptinS4(DS4)wasthentransformedintoDHl0BACTMcompetentcell．HighmolecularweightDNA，TherecombinantbacmidwaspreparedfrOmtheovemightculturesofselectedEschefichiacoliDHl0BACTMcolonies．WeextractedrecomplasmidandidentifieditwithuniversalprimerRVasprimersforPCRcation．4．Bytr

8、ansfectingspodoptemfragiperda9(SD)cellswiththerecombinantbacmid，therecombinantbacu