基于TLR2、TLR4基因沉默探索青藤碱对小鼠DC2.4炎性因子表达的影响.pdf

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1、ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine(基础医学院)二○一八届硕士研究生学位论文基于TLR2、TLR4基因沉默探索青藤碱对小鼠DC2.4炎性因子表达的影响ToexploretheeffectofsinomenineontheexpressionofDC2.4inflammatoryfactorsinmicebasedonTLR2andTLR4genesilencing研究生姓名：熊力群指导教师：高永翔教授学科专业：免疫学二○一八年五月学位论文基于TLR2、TLR4基因沉默探索青藤碱对小鼠DC2.4炎性因子表达的影响Toexplorethe

2、effectofsinomenineontheexpressionofDC2.4inflammatoryfactorsinmicebasedonTLR2andTLR4genesilencing熊力群指导教师姓名：高永翔（教授）申请学位级别：硕士专业名称：免疫学论文提交时间：2018年5月论文答辩时间：2018年5月本论文受资助基金：国家自然基金（NO:81173627）教育部博士点基金（NO:20105132110001）二○一八年五月成都中医药大学2018届硕士研究生学位论文中文摘要目的：采用细胞质粒转染技术选择性抑制小鼠树突状细胞上的TLR2、TLR4受体蛋白表达，探索青藤碱对类风湿关

3、节炎的抗炎机制，明确青藤碱对小鼠DC2.4调控作用的关键靶点，为治疗类风湿关节炎的实验研究提供新思路以及新药的研发提供实验依据。方法：1.针对小鼠树突状细胞上TLR2、TLR4受体蛋白，分别设计与合成重组质粒，应用细胞质粒转染技术选择性抑制TLR2、TLR4受体蛋白表达。Westernblot法分别测定TLR2、TLR4蛋白表达情况，筛选出针对TLR2、TLR4蛋白最佳沉默组质粒。2.按单一和联合沉默TLR2、TLR4原则，将DC2.4细胞分为空白组、沉默TLR2空白组、沉默TLR4空白组、共沉默TLR2+4空白组、模型组、沉默TLR2模型组、沉默TLR4模型组、共沉默TLR2+4模型组、

4、青藤碱组、沉默TLR2青藤碱组、沉默TLR4青藤碱组、共沉默TLR2+4青藤碱组、甲氨蝶呤组。除空白组、沉默TLR2空白组、沉默TLR4空白组、共沉默TLR2+4空白组外，其余各组分别加入1μg/ml的R848溶液培养24h，诱导小鼠DC2.4成熟产生免疫反应，青藤碱组、沉默TLR2青藤碱组、沉默TLR4青藤碱组、共沉默TLR2+4青藤碱组中再加入40μg/ml的青藤碱溶液，甲氨蝶呤组中加入25ng/ml的甲氨蝶呤溶液，继续培养48h。用ELISA法检测各组细胞上清液中IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α含量，Westernblot法分别测定各组细胞中IRAK-4、P65、P38蛋

5、白表达。结果：1.Westernblot法检测单一与共沉默TLR2、TLR4后蛋白表达（1）Westernblot法检测TLR2、TLR4蛋白表达，筛选出最佳沉默组1成都中医药大学2018届硕士研究生学位论文与空白组相比，转染试剂空白组和对照质粒转染组的TLR2/β-action、TLR4/β-action灰度值比均值无明显变化；TLR2-16#转染组、TLR2-17#转染组、TLR2-18#转染组、TLR4-19#转染组、TLR4-20#转染组、TLR2-21#转染组中TLR2/β-action、TLR4/β-action灰度值比均值呈不同程度的降低；与TLR2-16#转染组比较，TLR

6、2-17#转染组细胞中TLR2/β-action灰度值比均值升高，TLR2-18#转染组细胞中TLR2/β-action灰度值比均值降低。与各转染组比较，TLR2-18#转染组TLR2/β-action灰度值比均值最低；与TLR4-19#转染组比较，TLR4-20#转染组TLR4/β-action灰度值比均值明显降低；TLR4-21#转染组TLR4/β-action灰度值比均值降低。与TLR4-20#转染组比较，TLR4-21#转染组TLR4/β-action灰度值比均值升高。与各转染组比较，TLR4-20#转染组TLR4/β-action灰度值比均值最低。（2）Westernblot法检

7、测同时沉默TLR2、TLR4后蛋白表达与TLR4-20#转染组比较，TLR2-18#转染组和TLR2,4-18#,20#转染组的TLR2/β-action灰度值比均值明显降低。与TLR2-18#转染组比较，TLR4-20#转染组和TLR2,4-18#,20#转染组的TLR4/β-action灰度值比明显降低。2.青藤碱对TLR2、4基因沉默后小鼠DC2.4细胞炎性因子的表达影响ELISA法检测各组细胞上清液中IL-1β、