利用myf5诱导绵羊骨髓间充质干细胞为成肌细胞的研究

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2、．．ｙ蘇：论文评阅人；，！＇＾‘葉載苗譚蔡：．．■■Ｖ’一．叫．．乂．．；叛ｄ一：＾＇节．；／：雀乂學《从知ｓＪｌｉｉ如．鮮错点若奇為片、＾度；．；边；，化‘护轉押巧、皆纪销作＞呀々早．＇巧，成所诗喝巧皆Ｉ错巧：：心；Ａ踐狂．’＇＇．．＾．．Ａ声片＇＂．？Ｖ１＞－？＇－？，１：ｒ％．、＇；ｉ－，：错每读和；．屯安话巧；诗斧巧譜這為：学校代码：１０２２５学号：Ｓ１５４４７学化文利用Ｍｙ巧诱导绵羊骨髓间充质干细胞为成肌细胞的研究王緣指导教师姓名：安铁沫教授东北林业大学

3、申请学位级别；硕±学科专业：发育生物学论文提交日期：２０１５年４月论文答辩日期：２０１５年６月６授予学位单位：东北林业大学授予学位日期；２０１５年月答辩委员会主席：论文评阅人：遂如、＃寺丈學ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＣｏｄｅ：１０２２５ＲｅｇｉｓｔｅｒＣｏｄｅ：Ｓ１５４４７ＤｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅＤｅｒｅｅｏｆＭａｓｔｅｒｇＴｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｕｓｉｎＭ巧ｉｎｄｕｃｉｎｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｇｙｇｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｏｆｓｈｅｅｐ１：ｏｍｏｂｌａ

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5、（ＭｙｏＤ）、肌细胞生成素（Ｍｙｏｇｅｎｉｎ）、生肌因子５（Ｍｙｆ５）和生肌调节因子４（Ｍｒｆ４），它们具有单独或协同调节肌细胞的增殖和分化、肌纤维大小和数量等功能。为了建立利用小鼠Ｍｙ巧基因诱导绵羊骨髓间充质干细胞为成肌细胞的方法，本研究在Ｍｆ５ｃＤＮＡＭＤ１８－ＴＳｉｍｌ克隆小鼠ｙ基因的基础上，依次通过克隆载体Ｐｐｅ和表达载体－－ｃＤＮＡ３．１＋相连ｃＤＮ３．１ｆ５ＣＤＮｐ，构建真核表达载体ｐＡＭｙ；采用脂质体法将ＰＡ３．１（）Ｍｙｆ５转染绵羊骨髓间充质干细胞，Ｗ观察转染细胞分化形成成肌细胞的能力。其研究结果如下：１．Ｍｙｆ５基

6、因真核表达载体的构建参照ＧｅｎＢａｎｋ（ＡＫ０４４８９４）中序列，通过ＰＣＲ扩增提取小鼠肌肉组织中的总巧基因－ＲＮＡ，扩増获得Ｍ，与克隆载体１８ＴＳｉｍｌｅ相连ｙＰＭＤｐ，通过双酶切和测序鉴定后，与表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋）表达载体连接。经双酶切鉴定和测序结果显示，与理论－，ｃＤ巧序列相符表明成功获得Ｍｙ巧基因的真核表达载体ｐＮＡ３．１Ｍｙ；２．骨髓间充质干细胞转染和分化，经复苏后进行传代培养将冷冻保存的绵羊骨髓间充质干细胞，其结果，培养细胞呈现正常的形态和生长曲线；当传代培养后细胞约达到８０％汇合时，分别进行下列处－ＭＤＮＡ

7、３．１巧无内毒素质粒．５２理。Ａ组：转染ｐｃｙ，并加入含有０％ＤＭＳＯ的Ｆ１培养Ｂ组ＤＮＡ３－．１，２基：转染ＣＭ巧无内毒素质粒加入Ｆ１培养基：Ｃ组：含；Ｐｙ０．５％ＤＭＳＯ的Ｆ１２培养基。当转染后第１２ｄ开始，在倒置显微镜下，３组转染细胞均呈现成肌细胞样的细管状形态。３．转染细胞生物学检测（１）免疫巧光检测在转染细胞传代培养后的第１７ｄ，将上述３种细胞和作为对照，用兔ＭｙｏＤｏ未经转染的骨髓间充质干细胞、ＭｙＧ、ＤＥＳ抗体处理进行免疫癸光检测。其结果，与对照组不发生绿色巧光相比，Ｈ组转染细胞均出现绿色巧光；２２－（）流式细胞筛