两种茶树内源糖苷酶基因的表达、抗体制备及在不同品种中的差异表达研究

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1、分类号：０９巧９【Ｍ６４．单位代码：密级：；学号：１２７２０２８３签歡卷犬劈学位论文两种茶树内源巧昔酶基因的表达、抗体制备及在不同品种中的差异表达研究Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ乂ｎｔ化ｏｄｉｅｓＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄＤｉｆｅｒｅｎｔｉａｌＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｎａｌｓｉｓｏｆＴｗｏＥｎｄｏｅｎｏｕｓＧｌｙｃｏｓｉｄａｓｅｓｉｎｙｇＤｉｆｆｅｒｅｎｔＴｅａＣｕｌｔｉｖａｒｓ研巧生：倪帆呈指导教师；张正竹教授合作指导教师：申请学位口类级别：农学硕±专业

2、名称；茶学研充方向：茶叶生物化学与天然产物研发所在学院：茶与食品科技学院答辩委员会主席：卻０年Ｉ月独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研巧工作及取得的研巧成果。尽我所知，除了文中特别加标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料一同工作的同志对本研巧所做的任何贡献均已在论文中作了明。与我确的说明并表示了谢意。ｆ研究生签名：《时间：Ｄ曰啊扔，２衫年（月ｆ关于论文使用授权的说明送交论本人完全了解安徽农业大学有

3、关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可Ｗ采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。（保密的学位论文在解密后应进守此协议）研？究生签名：恃娜言时间；２（５年／月／／日一、第导师签名；乂时间：２娘年／月／／日摘要茶树，我国重要的经济作物；茶，世界三大非酒精饮料之一，有着重要的经济价值，其香气是影响茶叶品质优劣的重要因素。茶香中主要的挥发性物质单萜烯醇和芳香族醇等多以糖苷形式存在，且以樱草糖苷和葡萄糖苷为主。研究

4、表明，茶鲜叶经物理损伤后，细胞分室被破坏，致使内源糖苷酶与萜类香气苷元发生酶促水解反应，进而释放出香气。β-樱草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶是茶叶中主要的内源糖苷酶。茶树糖苷类香气前体不仅是茶叶香气形成的基础，而且参与了茶树对病虫害的防御。对于茶树内源糖苷酶已有相关报道，其克隆和表达工作也取得一定进展，但茶树中的β-樱草糖苷酶（Pri）和β-葡萄糖苷酶（Glu）未能固化并用于生产，且至今未有商业化抗体出售，这对从蛋白水平上研究内源糖苷酶造成了困难。本文通过克隆并表达关键性的内源糖苷酶，对内源糖苷酶进行多克隆抗体的制备和对不同茶树品种中内源糖苷酶基因表达差异分析，以及对茶叶萎凋过程中

5、β-葡萄糖苷酶活性变化的研究等，以期达到如下目的：提高大家对茶叶香气形成机理的了解，为提高茶叶香气品质奠定基础；为从蛋白水平上了解内源糖苷酶的表达差异提供可能；为茶树种质鉴定提供分子标记；为茶叶加工优化提供一定的理论指导。主要研究结果如下：1、根据本课题组从茶叶中分离纯化的可水解葡萄糖苷类香气前体的β-葡萄糖苷酶（Glu）的cDNA全长序列，和GenBank登陆的β-樱草糖苷酶（Pri）基因序列，设计原核表达引物。通过RT-PCR扩增获得Glu和Pri基因片段，分别插入pET-32(+)和pMAL-c5X中，成功构建表达载体pET-32a(+)-Pri/Glu、pMAL-c5

6、X-Pri/Glu和去信号肽pMAL-c5X-Pri/Glu。经IPTG诱导后，SDS-PAGE检测后发现，pET-32a(+)-Pri/Glu得到高效表达，但以包涵体形式存在，未检测到酶活性；pMAL-c5X-Pri/Glu未能表达；而去信号肽pMAL-c5X-Pri/Glu可在表达菌株BL21(DE3)中，经1mMIPTG，16℃，诱导20h后可溶性蛋白表达量最高，但未检测到酶活性。2、将pET-32a(+)-Pri/Glu载体表达产生的包涵体蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化，制备出Glu和Pri多克隆抗体。抗体经ELISA与Western-blot检测，效价为1∶100

7、000，且具有特异性。通过抗体与茶树种子总蛋白的特异性结合，表明β-樱草糖苷酶也可能存在于茶树种子中。3、设计Glu真核表达引物，通过RT-PCR扩增获得Glu基因片段，插入pESC-HIS，成功构建表达载体pESC-HIS-Glu。经半乳糖诱导表达后，SDS-PAGE分析及Western-blot检测表明蛋白得到表达。pNPG法酶活性检测结果表明，该表达蛋白具有活性，活性为0.24±0.03U。4、利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，研究了Pri、Glu两个基因在13个茶树品种中的表达情况。