β-细辛醚靶向rock通路抗阿尔茨海默病神经突触损伤的分子机制

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1、ｓ、．？？分类号咖５．５学校代号１０５７２ＵＤＣ６１０密级学号２０１２２１０４０９３？神翁：／１中法為大旁‘‘‘‘““ＧｕａｎｇｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｙｉｃｉｎｅ博士学位论文－ＲＯＣＫｇ细辛醚祀向通路抗阿尔茨海默病神经突触损伤的分子机制学位申请人李菲指导教师姓名陈东风教授专业名称中西医结合基础申请学位类型科学学位论文提交日期２０１５年５月‘“

2、－．？＊Ｓ‘－，．■■．／广州中医药大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经特别加以注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名令日期：年月日关于学位论文使用授权的声明本人完全了解广州中医药大学有关保留使

3、用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。本人授权广州中医药大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。（保密论文在解密后应遵守此规定）论文作者签念‘论文导师签名日ｋｇ：年月日摘要研究目的：’Ａ一阿尔茨海默病ｌｚｈｅｉｍｅｒｓｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ（）是种以进行性认知障碍和神经突触ｔ损伤为主要特征的神经退行性疾病，以ＡＰ淀粉

4、样蛋白聚集和ａｕ蛋白异常憐酸化形成的神经原纤维缠结作为主要病理特征，ＡＤ早期出现学习和记忆能力的下降与神经突触受损有直接相关性，其中，与ａｄ病因学密切相关的ＡＰ升高经研究证实可促进Ｒｏｃｋ通路的表达作用增强，出现神经突触的抑制作用，同时，Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ通路兴奋也能反向引起Ａｅ的异常集聚，ＣＫ。因此我们考虑ＲＯ通路作为药物的ＩＥ点研究其作用机制。中药石菖蒲化湿和胃，宁神益志，其性辛开苦燥温通，芳香走窜，具开穷醒神之功，且兼化湿，豁痰，辟移之效，常辅佐其他药物以加强祛痰

5、化湿之功。在前期研究－２中，我们发现石菖蒲有效成分中ｅ细辛醚对ＡＤ神经突触损伤有保护作用，对ＡＰ４ＲＯＣＫ，的异常集聚抑制作用不明显，同时，研究结果发现可能与表达有关但其具体机制仍不明确。因此，探索细辛酸把向ＲＯＣＫ，本研究通过建立ＡＤ动物和细胞模型通路对ＡＤ神经突触的保护作用的分子机制研究。研究方法：１１，．选用５月龄ＡＰＰ／ＰＳ小鼠作为ＡＤ动物模型进行实验研究野生型小鼠作为空白对照组，采用Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫检测小鼠行为学变化，用高尔基银染，刚果红染色从形

6、态学上观察小鼠大脑中海马突触损伤和皮质部位ｅ淀粉样蛋白的沉淀情况，观察０－Ｗｅｓｔｅｒｎｌｏｔ法检测突触细辛醚对小鼠行为学的影响和病理形态学上的作用；采用ｂ相关蛋白突触素Ｓｙｎａｐｓｉｎ１（ＳＹＮ１）和突触后密度蛋白９５抗体（ＰＳＤ９５）在ＡＰＰ／ＰＳ１ＯＣＫ，测Ｒ通路相关小鼠海马中的表达情况观察细辛醚对神经突触的保护作用；检２Ｌ－蛋白（Ｒ０ＣＫ，ＩＭＫ１）的表达情况，观察Ｐ细辛醚对ＲＯＣＫ通路的作用。２．采用ｍｉＲＮＡ基因芯片技术，对ＡＰＰ／ＰＳ１小鼠海马中ｆｌｉＲ

7、ＮＡ进行高通量筛选，－－并经ｑＲＴＰＣＲ实验进行有效验证，观察｛３细辛醚对ＡＰＰ／ＰＳ１小鼠海马组织中特异性表达ｍｉＲＮＡ的影响，考虑是否存在与ＲＯＣＫ通路等相关表达的ｍｉＲＮＡ。３Ｒ０ＣＫ２１－．通过构建启动子双突光素酶报告基因转染ＰＣ２细胞，用Ａｅ２５３５作为－处理因素，观察细辛酸对Ｒ０ＣＫ２启动子转录活性的作用。４ＷｂＧｒｏｗｔｈＡｓｓｏｃｉａｔｅｄ．采用免疫突光和ｅｓｔｅｒｎｌｏｔ法检测神经生长相关蛋白Ｐｒｏｔｅｉｎ－４３（ＧＡＰ４３）ＳＹＮｌｈｏ２抗

8、体（Ｒ０ＣＫ２）在ＡＤ细胞，突触素和Ｒ相关蛋白激酶－ＡＤＲ０ＣＫ２模型中的表达情况，Ｐ细辛酸对细胞模型的保护作用和对的表达影响观察。－－Ｒ０ＣＫ２－ｓｉＲＮＡＲ０ＣＫ２ｏｖｅｒｅｘｒｅｓｓｉｏｎ５，．通过和ｐ质粒转染ＡＤ细胞模型观察Ｐ细辛醚依赖Ｒ０ＣＫ２的药效作用。６ｉＲＮＡｉＲ－．构建特异性表达ｍ的模拟物和抑制物（如ｍ３３５），并经生物信息学预Ｉ’２－３－测后进行ＷＢ功能性验证ｉｎｉＲ３３５，再次通过构建Ｒ０ＣＫＵＴＲ区含的结合位点的双荧光素酶报告基因确定ｍｉ