uvrag基因在自噬及心脏结构功能维持中的作用

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1、上海交通大学博士学位论文UVRAG基因在自噬及心脏结构功能维持中的作用培养单位：上海交通大学院系：生命科学技术学院班级：A1108091学号：0110809056作者姓名：宋宗培指导老师：朱洪新研究方向：心血管疾病生物学上海交通大学生命科学与技术学院2015年9月DissertationSubmittedtoShanghaiJiaoTongUniversityfortheDegreeofPh.DEssentialroleforUVRAGinautophagyandmaintenanceofcardiacstructureandfunctionAuthor:Zongpei

2、SongSpecialty:CardiovascularBiologyAdvisor:Prof.HongxinZhuSchoolofLifeScienceandTechnologyShanghaiJiaoTongUniversityShanghai,P.R.ChinaSeptember,2015上海交通大学博士学位论文UVRAG基因在自噬及心脏结构功能维持中的作用摘要UVRAG（ultravioletradiationresistance-associatedgene）最初发现于着色性干皮病细胞中，它能部分地恢复该细胞对紫外线的耐受。后来UVRAG被鉴定为一个肿瘤抑制基

3、因，并且有多种生物学功能，例如细胞自噬，细胞內吞和DNA修复等。近来，大量的研究增加了对UVRAG的结构和多种生物学功能的理解，但是其生理学功能依然所知甚少。利用piggyBac（PB）转座子插入产生的UVRAG基因敲除小鼠模型，我们研究UVRAG在心脏细胞自噬和维持心脏形态和功能中的作用。PB转座子插入位点位于UVRAG基因的第十四个内含子，RT-PCR实验结果显示，PB转座子的插入干扰小鼠心脏组织UVRAGmRNA的表达。免疫印迹实验结果显示，敲除小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺、骨PB/PB骼肌和脑等组织中无UVRAG蛋白表达。但UVRAG缺失（UVRAG）小鼠依旧可存活

4、，有繁殖能力，发育正常。免疫印迹结果显示UVRAG缺失小鼠心脏中LC3II蛋白显著提高，提示其自噬体数量增加。LC3免疫荧光染色结果显示UVRAG缺失心脏细胞中LC3阳性荧光点状结构数量显著增加。透射电镜结果显示，I上海交通大学博士学位论文UVRAG缺失心脏中自噬体数量显著增加。自噬体合成增加和自噬清除受损均可导致自噬体数量增加。免疫印迹显示UVRAG缺失心脏中p62蛋白含量增加，提示自噬流受损。与野生型相比，UVRAG缺失小鼠心脏LC3II蛋白水平增加，氯喹（Chloroquine）处理小鼠阻断自噬体溶酶体融合后，野生型小鼠心脏LC3II显著提高，但是UVRAG缺失心

5、脏LC3II与处理前相比没有显著差异。表明UVRAG缺失心脏中自噬流受损，自噬体清除受阻导致自噬体累积。Westernblot结果显示UVRAG缺失心脏溶酶体分子标记物LAMP-1和LAMP-2都显著增加。在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中，UVRAG的缺失也导致自噬流受损，自噬体数量增加。在心脏形态和功能方面，两月龄和六月龄UVRAG缺失小鼠心脏拥有与野生型小鼠一样的形态和功能。但十月龄UVRAG缺失小鼠心脏体积显著大于野生型对照组。心脏组织横截面切片染色显示，UVRAG缺失小鼠心脏横截面变大，左心室室腔变大，心室壁变薄。H&E染色结果揭示，与野生型相比UVRAG缺失

6、小鼠单位视野内心肌细胞数量较少，单个心肌细胞横截面显著增加。表明十月龄时UVRAG缺失小鼠出现心肌肥厚。天狼猩红染色结果显示，十月龄UVRAG缺失小鼠心脏出现间质胶原累积。实时定量PCR结果显示，十月龄UVRAG缺失心脏心室重构分子标记物表达量显著升高，例如心钠素（ANF）和脑钠肽（BNP）。II上海交通大学博士学位论文免疫印迹实验结果显示，十月龄UVRAG缺失小鼠心脏组织Bax蛋白水平高于野生型对照组。TUNEL（Terminal-deoxynucleoitidylTransferaseMediatedNickEndLabeling）检测小鼠心脏切片，结果显示与野生型

7、相比十月龄UVRAG缺失小鼠心脏细胞凋亡数量显著增加。实时定量PCR结果显示，十月龄UVRAG缺失心脏促炎性细胞因子表达量显著增加，例如白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）和肿瘤坏死因子-α（Tumournecrosisfactor-α,TNFα）。免疫组织化学染色检测结果显示UVRAG缺失心脏CD45和CD45R阳性信号显著增加，表明心脏组织中有炎性细胞浸润。实时荧光定量PCR显示，十月龄UVRAG缺失小鼠心脏树突细胞分子标记物CD11c表达量显著高于野生型，单核细胞趋化因子MCP-1显著增加，而巨噬细胞前体细胞分子标