tigar在肝癌细胞对表阿霉素化疗耐受中的作用及相关机制研究

《tigar在肝癌细胞对表阿霉素化疗耐受中的作用及相关机制研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、SOOCHOWUNIVERSITY博士学位论文苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。论文作者签名:丨蜘純日期：>丨的々5苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权向国

2、家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研究所（含万方数据电子出版社)、中国学术期刊（光盘版）电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密论文口本学位论文属在_____年__月解密后适用本规定。非涉密论TIGAR在肝癌细胞对表阿霉素耐药中的作用及相关机制研究中文摘要TIGAR在肝癌细胞对表阿霉素耐药中的作用及相关机制研究中文摘要目的：观察化疗药表阿霉素对肝癌细胞p53诱导的糖酵解和凋亡调节子（TIGAR）蛋白表达的影响以及TIGAR在肝癌细胞对表阿霉

3、素化疗耐受中的作用；探讨TIGAR影响肝癌细胞对表阿霉素耐药的初步机制。方法：Westernblot法检测表阿霉素对肝癌细胞TIGAR蛋白表达的影响；采用小干扰RNA技术干扰肝癌细胞TIGAR表达后通过MTT及克隆形成实验分别检测干扰TIGAR表达联合表阿霉素治疗对肝癌细胞生存的短期和长期影响；AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测干扰TIGAR表达联合表阿霉素治疗对肝癌细胞凋亡的影响；采用慢病毒构建的TIGAR-shRNA感染HepG2肝癌细胞，经嘌呤霉素筛选，westernblot及细胞免疫荧光法检测干扰效率，得到稳转株后通过裸鼠成瘤实验检测干扰TIGAR表达对肝癌肿瘤形成、生

4、长及其对表阿霉素化疗疗效的影响；2’,7’-二氯二氢荧光素双醋酸盐（DCFH2-DA）标记流式细胞术、GSH检测试剂盒及NADPH检测试剂盒分别检测细胞内活性氧（ROS）水平、GSH/GSSG比值及NADPH水平；Westernblot检测细胞内凋亡相关蛋白水平；细胞免疫荧光法、westernblot及电镜技术检测干扰TIGAR表达对肝癌细胞自噬的影响；彗星实验检测细胞DNA损伤情况；采用细胞核质分离技术分离细胞核后westernblot分别检测胞浆及胞核中TIGAR的表达；运用细胞免疫荧光及westernblot技术检测DNA损伤修复中相关蛋白ATM、Cdk5等的表达。结果：为了研究表阿霉素

5、对肝癌细胞TIGAR表达的影响，我们采用不同浓度的表阿霉素作用肝癌HepG2细胞不同时间后，westernblot检测TIGAR表达，结果显示，低浓度短时间的表阿霉素作用可诱导HepG2肝癌细胞TIGAR表达，高浓度长时间的表阿霉素作用后TIGAR表达下调。且表阿霉素诱导的TIGAR表达是依赖p53变化的。为了进一步探讨表阿霉素诱导的肝癌细胞TIGAR高表达在肝癌细胞对表阿霉素疗效中的作用，我们采用小干扰RNA干扰肝癌HepG2细胞TIGAR表达后通过MTT、克I中文摘要TIGAR在肝癌细胞对表阿霉素耐药中的作用及相关机制研究隆形成实验及流式等体外实验检测发现，干扰TIGAR表达联合表阿霉素作

6、用后肝癌HepG2细胞的存活明显下降，细胞凋亡显著增加；此外，通过体内实验即裸鼠成瘤实验检测干扰TIGAR表达对肝癌细胞成瘤的影响以及移植瘤对表阿霉素疗效的影响，结果显示，干扰TIGAR表达抑制肝癌的形成和生长，同时也增加了其对表阿霉素的化疗敏感性。研究还发现，不仅对于肝癌细胞，表阿霉素也增加了肺癌A549细胞的TIGAR表达且干扰TIGAR表达增加肺癌A549细胞对表阿霉素的化疗敏感性。肿瘤的化疗耐受与多种机制相关，其中ROS适应性反应、细胞自噬及细胞DNA损伤修复在肿瘤化疗耐药的形成中起着重要作用，TIGAR作为p53下游基因，通过抑制细胞糖酵解及增加磷酸戊糖通路产生NADPH降低细胞内R

7、OS水平，从而降低ROS引起的细胞凋亡、ROS介导的细胞自噬激活及ROS诱导的DNA损伤修复，此外，磷酸戊糖通路的激活增加了DNA合成原料核苷酸的生成，有利于受损DNA的修复。因此，为了进一步探讨干扰TIGAR表达在肝癌细胞对表阿霉素化疗增敏中的机制，我们从细胞凋亡、细胞自噬及细胞DNA损伤修复三方面来进行研究。第一，干扰TIGAR表达显著增加表阿霉素诱导的肝癌细胞凋亡，并与ROS水平增加、Cas