lin28在乳腺癌化疗耐受中的作用及机制研究

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1、浙江大学博士学位论文Lin28在乳腺癌化疗耐受中的作用及机制研究姓名：吕可真申请学位级别：博士专业：肿瘤学指导教师：滕理送201205浙江大学博t学位论文中文摘要1in28在乳腺癌化疗耐受中的作用及机制研究浙江大学医学院肿瘤学博士研究生导师中文摘要吕可真滕理送教授1．实验背景和目的：化疗耐药是目前肿瘤治疗中所面临的一个巨大挑战。目前，在肿瘤耐药机制研究中最热门的研究之一是肿瘤干细胞与化疗耐药相关性的研究。近些年来诸多证据表明许多恶性肿瘤的耐药性与其肿瘤干细胞密切相关。研究发现干细胞相关基因1in28与恶性肿瘤的发生、进

2、展、预后以及诱导多功能干细胞形成等密切相关。另外，我们的前期研究提示1in28在多种恶性肿瘤耐药细胞株中的表达较其母代细胞株表达水平明显升高。由此，我们推测作为干细胞相关基因lin28可能与肿瘤化疗耐药相关．到目前为止，尚未见有关Iin28与肿瘤化疗耐药相关性研究的报道。本研究目的旨在探讨干细胞相关基因lin28与乳腺癌细胞紫杉醇(paclitaxel．PAC)耐药的相关性，并进一步研究其可能的内在机制，为克服乳腺癌化疗耐药提供新的靶点。2．实验方法：(1)为了解lin28的表达是否与乳腺癌的化疗耐受相关，我们以wes

3、ternblot法检测了5株乳腺癌细胞株(SK-BR．3，MCF．7，Bcap-37，MDA一231，T47D)中lin28的表达水平，并进一步采用M订比色法检测了该5株乳腺癌细胞株对paclitaxel的敏感性。Il浙江大学博士学位论文中文摘要(2)为进一步明确Iin28的表达水平是否影响乳腺癌细胞对paclitaxel的敏感性，我们以lin28siRNA敲低了高表达lin28的乳腺癌细胞株T47D细胞中lin28的表达，然后采用MTT比色法检测lin28敲低前后T47D对paelitaxel的化疗敏感性的变化．(3

4、)为进一步证实lin28的表达水平在调节乳癌细胞对paclitaxel化疗敏感性中的作用，我们建立了3株稳定表达lin28基因的SK-BR．3细胞克隆(S1，S24，$27)以及1株稳定表达lin28基因的Bcap．37细胞克隆(B1)，然后采用MTT比色法检测上述稳定表达lin28基因的细胞克隆对paclitaxel的化疗敏感性的变化．(4)同时，采用流式细胞技术检测paclitaxel对上述in28稳定表达细胞克隆的凋亡的影响。(5)以westernblot法检测paelitaxel作用lin28稳定表达细胞株$2

5、4中PARP一的表达，进一步验证lin28抑制paclitaxel对乳癌细胞的凋亡诱导作用。(6)我们以免疫组化法检测了乳癌复发转移组织及新辅助化疗前后乳癌组织_．中1in28表达的变化，以了解lird8的表达与肿瘤对化疗敏感性的关系。(7)为探讨lin28诱导乳腺癌paclitaxel耐药的可能机制，我们以westernblot法检测了SK．BR．3／mock细胞株及其lin28稳定表达细胞克隆S1，$24，s2广冲MRP．1耐药蛋白以及p21，Rb，cyclibl和AKT等恶性肿瘤重要分子通路基因的表达。(8)为进

6、一步探究lin28诱导乳癌paclitaxel耐药的机制，我们以real-timePCR法检测了SK．BR．3细胞株及其1in28稳定表达细胞克隆S1，$24，$27中1in28的下游调控分子l吼．7miRNA的表达水平。(9)为进一步明确1et．7miRNA在介导1in28诱导乳癌细胞paclitaxel化疗耐受中的作用，我们将pre．1et．7amiRNA转染到lird8稳转细胞株Sl中，提高S1细胞中let．7miRNA的表达后，MTT比色法检测该细胞克隆对paclitaxel的敏感性的变化。III浙江大学博士学

7、位论文中文摘要3．实验结果：(1)5株乳腺癌细胞株(SK-BR一3，MCF．7，Bcap．37，MDA．231，T47D)中，T47D细胞的Iin28表达水平明显高于其他细胞株，经paelitaxel作用后的IC50值(48．201xM)也明显高于其他细胞株(4．401．tM一9．801xM)。(2)T47D细胞以siRNA特异性敲低lin28的表达水平后，测paditaxel作用的IC50值明显低于对照组(p<0．05)。(3)Lin28稳定表达的乳腺癌细胞克隆(S1，$24，$27)对paclitaxel的敏感性低

8、于对照组。其IC50值分别为：22．301xM(s1)，32．309M(s24)和35．601aM(s27)。对照组的IC50值为：9．90I-tM。此外，westernblot的检测结果表明，在lin28稳定表达的三株细胞克隆中，$27的表达强度最强，sl的表达最弱，与其对paclitaxel的敏感性呈负相关。同样，在另外一株乳