il-23在肝细胞肝癌发展中的作用及机制研究

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1、系nSOOCHOWUNIVERSITY硕士学位论文论文题目研究生姓名指导教师姓名刘海燕专业名称免疫学•研究方向肿瘤免疫论文提交日期2015年4月论∷文∷作∷者∷签名簸∷彡∫∷氵i`∷∷∷∷苏州大学学位论文使用授权声明∷∷∷∷∷∷∷∷∷∷∷∷∷本人完全了解苏州大学关于收集

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5、缩印或其他复.翻手段∷∷∷∷∷∷∷∷∷保存和∷汇编学位论文:∷可以将学位论文∷的全部或部分内容编入翥关数∷∷∷∷∷∷∷∷∷∷∷捃庠进行硷∷索i∷∷∷∷∷∷∷∷∷∷∷∷∷∷∷∷∷∷∷∷∷∷∷∷∷∷∷∷∷∷∷∷∷∷∷∷∷∷∷∷涉密论文臼∷∷∷∷∷∷∷∷∷∷∵∷∷∷∷∷∷∷本学∷位∷诊∷文犀∷∷∷∷∷∷在年⊥月解密盾∷适∷用∷餐飙

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15、卫∷∷∷∷∷∷∷∷∷IL-23在肝细胞肝癌发展中的作用及机制研究中文摘要中文摘要第一部分IL-23表达质粒和稳转细胞系的构建目的：小鼠IL-23融合基因片段的克隆及hepa1-6稳转细胞系的构建。方法：取小鼠hepa1-6细胞提取总RNA,通过RT-PCR克隆p19基因的编码区和p40基因编码区的成熟区；采用重叠延伸PCR的方法

16、，通过编码一段柔性肽段(Gly4Ser)3的DNA序列连接p19片段和p40片段，构建小鼠IL-23单链融合基因，添加酶切位点，并将其克隆至pRRL-Venus慢病毒载体中。通过包装慢病毒感染hepa1-6细胞，再通过流式分选的方法筛得可以稳定表达IL-23的hepa1-6稳转细胞系。结果：DNA测序结果表明：小鼠IL-23融合基因中p19、linker及p40的连接顺序、方向及翻译成氨基酸序列完全正确。结论：成功克隆小鼠IL-23单链融合基因并构建其慢病毒质粒。成功构建可以稳定表达IL-23的hepa1-6稳转细胞系。为进一

17、步研究IL-23在肝细胞肝癌发展中的作用及其机制奠定了基础。关键词：小鼠IL-23；融合基因；重叠延伸PCR；稳转细胞系第二部分IL-23对肝细胞肝癌细胞系的生物学行为的影响目的：体外检测IL-23对肝细胞肝癌细胞的生物学行为的影响。方法：通过一系列体外实验检测IL-23对肝细胞肝癌细胞的生物学行为的影响。包括：采用MTT实验、Ki-67染色实验检测IL-23对肝细胞肝癌细胞的生长、增殖的影响；通过AnnexinV和7AAD的流式染色检测IL-23对肝癌细胞的细胞凋亡的影响；通过细胞周期的流式染色检测IL-23对肝癌细胞的细胞

18、周期的影响；通过划痕实验及transwell实验检测IL-23对肝癌细胞的迁移能力的影响。结果：MTT实验和Ki-67染色结果显示IL-23促进肝癌细胞的增殖；细胞凋亡的染色结果表明IL-23不影响肝癌细胞的细胞凋亡；细胞周期的结果表明IL-23I中文摘要IL-23在肝细胞肝癌发展中的作用及机制研究促进肝癌细胞维持在S期和G2期；划痕实验和transwell实验提示IL-23可以促进肝癌细胞的迁移。结论：体外实验揭示IL-23可以促进肝癌细胞的生长、增殖和迁移，并且可以促进肝癌细胞维持在S期和G2期，但是不影响肝癌细胞的细胞凋

19、亡。关键词：MTT实验；Ki-67；细胞凋亡；细胞周期；迁移第三部分IL-23在肝细胞肝癌发展中的作用及机制的研究目的：利用小鼠肝癌动物模型探究IL-23在肝细胞肝癌发展中的作用及其可能的机制。方法：(1)构建肝癌模型：(a.)取对数生长期的hepa1-6稳转细胞用PBS制成56单细胞悬液(5×10/ml)，每只小鼠注射的细胞量为1×10/2mlPBS，利用高压水流动力学的注射方法在5-8s内将细胞通过尾静脉注射到小鼠体内。3周后处死小鼠，取出小鼠肝脏，计数肝脏肿瘤结节数；(b.)提前一周给小鼠喝含抗生素(80000U/250

20、ml)的酸性水。取对数生长期的hepa1-6稳转细胞用PBS制成单细胞悬76液(4×10/ml)，每只小鼠注射的细胞量为1×10/25μlPBS，利用手术的方法，在超净工作台中，将小鼠腹部剖开一小口，挤出肝脏一叶，用胰岛素注射器吸取细胞缓慢的注射入暴露的肝脏中，再将小鼠伤口缝