循环mir-429在肝细胞性肝癌早期预警及诊断中的作用和机制研究

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1、第二军医大学博士学位论文循环miR--429在肝细胞性肝癌早期预警及诊断中的作用和机制研究姓名：李亮申请学位级别：博士专业：肿瘤学指导教师：王红阳201205循环miR-429在肝细胞性肝癌早期预警及诊断中的作用和机制研究摘要一循环miR一429在肝细胞性肝癌早期预警及诊断中的作用和机制研究(一)研究背景和目的：肝细胞性肝癌(HCC)是肝脏最常见的恶性肿瘤，占世界范围内癌症相关死亡的第三位。由于利用现有的肝癌诊断方法大多数肝癌患者被确诊时已为晚期，导致其5年生存率低至10％一15％，所以对癌症发生的早期预测和早期检测对于选择有效的治疗方法来说至关重要。目前使用得最广泛的

2、肝癌筛检方法包括血清甲胎蛋白(AFP)检测和B超等影像学检查等。然而，这些传统的方法都彳<能用作肝癌早期预测的理想指标。相当多的肝细胞性肝癌病人表现出甲胎蛋白水平低或正常，与之相反，约20％一25％的慢性肝炎、肝硬化及其他肝脏疾病患者具有较高AFP水平。另一方面，虽然改进的成像技术使人们有可能发现肝脏局灶性小病变，但是还很难区分良性病变与肿瘤，并且诊断结果与技术操作人员的经验密切相关，受主观因素影响较大。由于血清甲胎蛋白和影响学检查都不是理想的肝癌预测及检查方法，也就促使我们去发现更加敏感和特异的标志物，以期利用这些可能的方法与传统的检查方法一起对肿瘤高危人群发生HCC

3、的可能性进行监测。mJRNAs是一种内源性的、长约22nt的RNA，它通过靶向mRNA导致其降解或翻译抑制而在动、植物中起到重要的调节作用。miRNAs广泛存在于灵长类、啮齿类、鸟类、鱼类、蝇类、蠕虫类、植物、病毒中，从2002年有统计的200多种到2008年底的将近9000种，miRNAs的发现呈现爆发性增长，并且不断有新物种中的miRNAs被发现。人类miRNAs基因仅约占基因总数的2％-3％，但却能调控人体内1／3的蛋白表达，这种转录后调控作用直接影响了这些靶基因的功能，参与了包括消化系统在内的多个系统的生理、病理过程。miRNAs在消化系统中的作用涉及发育、老化

4、、分泌、代谢、病毒感染、免疫反应、肿瘤等等方面，尤其是作为癌基因或者抑癌基因在肿瘤发生发展中的作用显的尤为重要。有研究表明，不同类型的消化系统肿瘤有特定的miRNAs异常表达，和mRNA表达谱的零散不同，miRNAs在特定肿瘤中聚集成簇表达，如miR一192、miR-194、miR-215在肠源性肿瘤中成簇高表达，因此miRNAs可以作为第二军医大学博士学位论文癌症诊断的工具。很多不同的研究还表明，miRNAs的表达在肝细胞性肝癌中是异常失调的，并且和肿瘤细胞的生长、凋亡、迁移或侵袭有关，这也就提示我们miRNAs也许能够作为肝癌诊断的一种新的方法。最新的一些研究表明，

5、循环miRNAs可以作为理想的血源性新型生物标志物用于肿瘤的早期检测。此外，血清miRNAs的定量被认为可以有力地反映早期肿瘤状况或者极低肿瘤负荷情况。基于以上分析，循环miRNAs被用来作为非侵入性地监督肝癌高危患者的新的分子标记具有理论可行性。本研究主要的研究对象为包含3070个慢性HBsAg一阳性病人的每年进行体检的队列，我们首先收集了其中发生肝癌的患者确诊半年至一年以前的血清，通过筛选出与未发生肝癌者相比差异表达的miRNAs谱，以期得到能够预测病毒性肝炎患者发生肝癌的可能性的循环miRNAs指纹图谱，并进一步探讨这些循环miRNAs的来源、作用方式以及调控机制

6、。(二)实验方法：1．利用低密度芯片筛选在影象学诊断肝癌前约6—12个月的循环小RNA特征。2．利用Taqman探针对筛选出来的循环miRNAs进行大样本单独验证。3．通过ROC曲线评价筛选出来的循环miRNAs对于预测肝癌的特异性、敏感性；通过Logistic回归的方法判断筛选出来的循环miRNAs是否肝癌的独立危险因素，并与AFP进行比较。4．通过Logistic回归方程得到的Cutoff值建立肝癌发生风险的指标，并对该指标的可行性进行验证。5．利用Taqman探针对肝癌细胞系内，细胞培养上清中的相应miRNAs进行定量，以探讨筛选出的循环miRNAs是否肿瘤来源。

7、6．通过磁珠分选出EpCAM+及CDl33+的肿瘤细胞，通过对其相应miRNAs的表达检测，分析其是否肿瘤起始细胞来源。7．通过相应miRNAs的过表达以及干扰，验证其对于肿瘤起始细胞特性的影响。8．利用AffymetrixHumanU133plus2．0基因芯片，筛选出相应miRNAs的靶基因，通过构建该基因的过表达质粒，探讨该基因的功能。9．通过NOD-SCID老鼠皮下荷瘤实验，体内水平验证相应miRNAs及其靶基因在肝癌发生发展中的作用。10．通过DNA甲基化分析，探讨相应miRNAs的异常表达是否和DNA甲基化有关。(三)结果：1