tgf β-smad信号通路对猪颗粒细胞和繁殖性状的作用研究

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1、分类号：密级：学号：2012108005单位代码：10759石河子大学硕士学位论文TGFβ-SMAD信号通路对猪颗粒细胞和繁殖性状的作用研究学位申请人徐梦思指导教师黄涛副教授申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称动物遗传育种与繁殖研究方向动物遗传利用与分子育种所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2015年6月TheinfluenceofTGFbetaSMADsignalingpathwayonthepiggranulosacellsandreproductivetraitsADissertatio

2、nSubmittedtoShiheziUniversityInFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgriculture(AnimalGeneticsandBreeding)ByXuMengsiDissertationSupervisor:HUANGTAOJUNE,2015本课题受国家自然基金项目（30901014、31060295、31460586）、国家国际科技合作项目（2014DFA31840）、教育部留学归国人员科研启动基金（2

3、013-1092）资助。摘要哺乳动物的卵泡早期发育包括始基卵泡的形成和随后向初级卵泡、次级卵泡的转化，TGFβ信号通路在这一过程中发挥着重要的作用。该信号通路的激活是由TGFβ超家族的TGFβs配体分子与其受体结合，从而使受体磷酸化，磷酸化的受体再直接作用于SMAD蛋白，SMAD蛋白将配体和受体的作用信号传递到细胞核内，从而调控特定基因的表达。TGFβ1和TGFβRⅠ作为TGFβ信号通路的核心因子，在其信号转导中起着重要的作用，参与调节卵泡发育、卵母细胞和颗粒细胞以及颗粒细胞和卵泡腔细胞之间的双向信

4、号转导。OSP1启动子是目前已知的能够在卵巢组织中高效表达的启动子，能够为研究外源基因在猪卵巢颗粒细胞中的作用提供可行的调控元件。因此，本研究针对TGFβ1和TGFβRⅠ基因对猪卵泡发育的作用，设计以下实验，具体研究内容如下：（1）采集梅山与杜洛克经产母猪各3头的卵泡样品，经qRT-PCR方法检测TGFβ/SMAD信号通路基因，THBS1、DCN、LTBP1、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TGFβRⅠ、TGFβRⅡ、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SKP1基因在梅山、杜洛克S、M1、M2、

5、L卵泡中的表达量变化。结果表明：TGFβ/SMAD信号通路基因均在梅山与杜洛克的M2卵泡中存在表达差异，特别是LTBP1、TGFβ1及TGFβRⅠ基因在梅山猪各级卵泡中的表达量均极显著高于杜洛克（P＜0.01），这提示TGFβ/SMAD基因可能参与卵泡发育过程。（2）根据已知大鼠OSP-1启动子序列扩增大鼠OSP-1片段，将其定向克隆到pcDNA3.1（+）中替代CMV启动子，并在其下游插入ZsGREEN基因片段，构建真核表达载体TMpOSP-1-ZsGREEN；重组质粒在脂质体Lipofectam

6、ine2000的介导下转染不同细胞，在荧光显微镜下观察ZsGREEN表达情况，qRT-PCR方法检测该启动子在不同细胞中启动ZsGREEN基因表达的活性。结果显示：经克隆测序，得到了465bpOSP-1启动子序列，重组质粒转染卵巢颗粒细胞、Hela细胞可以观察到绿色荧光；qRT-PCR分析ZsGREEN基因在猪卵巢颗粒细胞、Hela细胞中高表达，在肌细胞中表达量极低，表明OSP-1启动子可驱动外源基因在猪卵巢颗粒细胞中高效表达，为构建可用于猪卵巢颗粒细胞的表达载体提供了启动子。（3）根据GenBan

7、k中猪的TGFβRⅠ基因mRNA序列，针对基因编码区设计5对shRNA干扰片段。以pPLL3.7作为载体骨架，通过替换其中CMV启动子，分别构建了pCMV-TGFβRⅠ-shRNA及pOSP1-TGFβRⅠ-shRNA干扰载体，通过脂质体TMLipofectamine2000转染猪卵巢颗粒细胞，分析TGFβRⅠ基因的相对表达量，检测pOSP1-TGFβRⅠ-sh5干扰载体及在细胞培养液中添加细胞生长因子TGFβ1处理对猪卵巢颗粒细胞的细胞增殖、细胞凋亡的影响。结果显示：经测序证实，5对合链的干扰片段

8、和OSP1启动子插入位置符合预期，且上下游表达调控元件完整，表明pCMV-TGFβRⅠ-shRNA及pOSP1-TGFβRⅠ-shRNA干扰载体构建成功；qRT-PCR分析TGFβRⅠ基因在猪卵巢颗粒细I胞中的表达量，含有OSP1启动子的干扰载体干扰效率高于CMV启动子干扰载体，差异显著（P＜0.05）。5个pOSP1-TGFβRⅠ-shRNA干扰载体的干扰效率依次为64%、56%、61%、62%、78%，其中pOSP1-TGFβRⅠ-sh5对TGFβRⅠ基因的沉默效