nefas和bhba对奶牛中性粒细胞tlr24-nf-κb信号通路的影响

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1、NEFAs和BHBA对奶牛中性粒细胞TLR2/4-NF-κB信号通路的影响TheeffectofNEFAsandBHBAsonTLR2/4mediatedNF-κBsignalingpathwayincowneutrophil作者姓名：张玉明冷春青专业名称：临床兽医指导教师：刘国文教授韦旭斌教授学位类别：学术学位答辩日期：2015年06月05日本研究由“国家自然科学基金资助项目”（31372494,31402265,31472247）资助ThisresearchwasfundedbygrantfromtheNaturalScienceFoundationofCh

2、ina（31372494,31402265,31472247）中文摘要NEFAs和BHBA对奶牛中性粒细胞TLR2/4-NF-κB信号通路的影响奶牛酮病以血液中高浓度的非酯化脂肪酸（non-esterifiedfattyacids，NEFAs）和β-羟丁酸（β-hydroxybutyrate，BHBA）为临床病理学特征。高NEFA和BHBA血症参与奶牛中性粒细胞（PMN）免疫功能的调节，尤其是炎症性疾病（例如乳腺炎和子宫内膜炎）。然而，在奶牛中性粒细胞，高浓度的NEFAs和BHBA是否能够激活TLR2/4介导的核因子-κB（nuclearfactor-κB，NF

3、-κB）信号通路从而诱导奶牛中性粒细胞的炎性损伤，目前尚不清楚。首先通过在体实验，观测酮病奶牛PMN中TLR2/4-NF-κB信号通路的变化，实验结果表明，酮病奶牛相比较于健康奶牛，PMNTLR2、TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-6和IL-1β基因表达显著上调，IKKβ激酶活性显著增加，同时血清（浆）中炎性因子TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌量显著增高，进一步说明酮病奶牛存在一定程度的炎症。为确定NEFAs和BHBA血症引发酮病奶牛中性粒细胞炎性损伤的机制，体外中性粒细胞培养液中添加不同浓度的NEFAs、BHBA、NF-κB通路抑制剂PDTC，观察

4、其对原代奶牛中性粒细胞TLR2/4-NF-κB信号通路及其介导的下游炎性因子的影响。首先分离奶牛中性粒细胞，并进行鉴定，之后添加不同浓度的NEFAs和BHBA，采用MTT法及CCK8检测其细胞的增殖活性，作用多个时间点后，最终确定NEFAs和BHBA最佳作用时间点分别为为4h和5h。随后添加不同浓度的NEFAs（0、0.125、0.25、0.5、1和2mMNEFAs）、10μMPDTC、10μMPDTC+0.5mMNEFAs作用4h和不同浓度的BHBA（0、0.5、1、2、4和6mM）、10μMPDTC、10μMPDTC+2mMBHBA、BHBA作用5h。实验结

5、果表明，与对照组相比，高浓度NEFAs（≥0.5mM）和BHBA（≥1.2mM）试验组IKKβ激酶活性和磷酸化IκBá蛋白的表达显著增加，同时NF-κBp65蛋白表达和转录活性也表现出与之同样的趋势。而促炎因子TNFα、IL-6和IL-1β的表达和释放呈现出相同的趋势，这说明高浓度NEFAs（≥0.5mM）和BHBA（≥1.2mM）可触发奶牛中性粒细胞自身免I疫性的炎性损伤。而在添加NF-κB通路抑制剂PDTC后，IκBα蛋白的磷酸化水平和NF-κBp65蛋白表达和转录活性及其靶基因的表达均显著降低。以上结果表明，高浓度NEFAs（≥0.5mM）和BHBA（≥1

6、.2mM）能够显著上调PMNTLR2和TLR4，激活NF-κB信号通路，促进中性粒细胞炎性因子TNFα、IL-6和IL-1β的合成和释放，引起奶牛PMN炎性损伤，从而导致酮病奶牛免疫机能低下。关键词：酮病，中性粒细胞，炎性损伤，NF-κB信号通路，免疫机能低下IIAbstractTheeffectofNEFAsandBHBAsonTLR2/4mediatedNF-κBsignalingpathwayincowneutrophilIt’sclinicalpathologycharacteristicedofhighconcerntrationno-esterifi

7、edfattyacids(NEFAs)andß-hydroxybutyricacid(BHBA)inbloodforketosisdairycows.HighNEFAsandBHBAcaninvolveinregulateneutrophil(PMN)immunefunction,espesciallyininflammatorydiseases(suchasmastitisandendomertritis).But,ItisunclearwhetherhighconcentrationofNEFAsandBHBAcanactivateTLR2/4-NF-κBs

8、ignalingpath