microrna-135a在h_2o_2诱导大鼠心肌细胞凋亡中的作用及其机制研究

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1、MicroRNA-135a在H2O2诱导大鼠心肌细胞凋亡中的作用及其机制研究TheroleofMicroRNA-135aintheinjuryinducedbyhydrogenperoxideinratcardiomyoblastcells作者姓名：崔燕专业名称：内科学研究方向：心肌细胞损伤指导教师：刘斌教授学位类别：医学博士培养单位：吉林大学第二医院论文答辩日期：2015年6月2日授予学位日期：2015年月日论文评阅人：答辩委员会组成：姓名职称工作单位姓名职称工作单位于波教授哈尔滨医科大学主席李学奇教授哈尔滨医科大学附属第二医院附属第四医院张梅教授山东大学齐鲁医院委员孙连坤教授吉林大

2、学基础医学院田野教授哈尔滨医科大学白小涓教授中国医科大学附属第一医院盛京医院李为民教授哈尔滨医科大学李淑梅教授吉林大学第二医院附属第一医院刘斌教授吉林大学第二医院孙英贤教授中国医科大学郑连文副教授吉林大学第二医院附属第一医院中文摘要MicroRNA-135a在H2O2诱导大鼠心肌细胞损伤中的作用及其机制研究目前缺血性心脏病已成为人类发病率和死亡率最高的疾病之一，其发病原因大多数是与年龄、肥胖、糖尿病、高血压、高血脂及遗传等易患因素相关。临床上对于缺血性心脏病的治疗主要是通过减少心肌氧耗、抑制心肌细胞凋亡、增加冠脉血流和实施血运重建，从而来改善心肌缺血。目前对于心肌缺血病理生理学的研究发

3、现，活性氧在心肌细胞损伤过程中起到了关键性调控作用，多种基因、转录因子以及氧敏感因子信号途径都可能参与了ROS介导的心肌细胞损伤。凋亡也被称为程序化细胞死亡，分为内源性凋亡和外源性凋亡两条途径。外源性凋亡通过激活胞膜上的死亡受体介导的，包括Fas、肿瘤坏死因子（TNF）和TNF相关配体。而内源性凋亡主要是通过调节Bcl-2蛋白家族诱导的，包括Bax、Bak、Bcl-2和Bcl-XL等信号蛋白。而Bcl-2蛋白是内源性凋亡级联反应的关键调控因子，它通过维持线粒体膜的稳定性抑制凋亡，很多凋亡的发生可能是通过抑制Bcl-2蛋白表达诱导的。已经有研究发现Bcl-2蛋白在心肌细胞损伤过程中起到重

4、要的调控作用，但具体的调节机制还不十分清楚。microRNA是近年来发现的一个非编码的小RNA，通过对其靶基因表达的调节，参与了包括细胞增殖、分化、凋亡、衰老等各种生理病理过程。同时，microRNA的生成也受到转录因子和其他因I素的调节。在细胞核内，microRNA通过5’端第2-8核苷酸与靶mRNA的3’端非翻译区(untranslatedregion，UTR)部分序列的配对结合抑制RNA翻译或降解靶microRNA，microRNA在转录后水平调节体内30％以上的mRNA。在心脏的发育分化以及疾病过程中，心肌特异性转录因子自身同样受到复杂的调节，近年来miRNA对其调控作用的研究

5、引起人们普遍的关注。microRNA不仅在心脏发育中起到重要的调控作用，在心肌肥大、心律失常、心肌纤维化、心肌梗死、心力衰竭和心肌细胞凋亡等病理情况下，microRNA也同样发挥重要作用。目前已经有研究发现microRNA与心肌缺血的发生发展密切相关：部分microRNA在缺血的心肌细胞中表达增高，并且其表达水平与心脏缺氧缺血程度相关；还有研究发现在不同心肌缺血部位同一microRNA的表达也有很大差别；进一步研究表明microRNA在缺血再灌注损伤的过程中对细胞凋亡的调控起到重要作用。这些研究提示我们，microRNA在心肌缺血中表达和调控具有多样性和复杂性。最新的研究发现，micr

6、oRNA-135a在心脏疾病中具有重要的调控作用，microRNA-135a能调控RAAS系统和盐皮质激素受体，并且转染高表达microRNA-135a质粒促进了纤维连接蛋白和胶原蛋白I的表达，在我们工作组前期研究利用microRNA芯片技术检测应激大鼠模型心肌组织差异表达发现，无论是在急性应激还是慢性应激，大鼠心肌组织中microRNA-135a发生显著变化。在肿瘤学的研究中表明，microRNA-135a通过调控不同靶基因参与细胞凋亡通路的调控，从而影响细胞的存活。因此本研究通过用过氧化氢处理大鼠心肌细胞，检测microRNA-135a在氧化损伤过程中的表达，通过分别构建高表达和I

7、I低表达microRNA-135a质粒，来明确在过氧化氢诱导氧化应激过程中起调控作用，以及其对下游靶基因Bcl-2蛋白的调控作用，从而阐明microRNA-135a对心肌缺血导致细胞凋亡的影响及其作用机制，为临床基因诊断和治疗心肌梗死提供新的靶点。方法(1)MTT法检测H2O2对大鼠心肌细胞H9c2生存率的影响。(2)通过JC-1染色及流式细胞术检测线粒体膜电势的变化；AnnexinV-PI检测细胞凋亡变化。(3)qRT-PCR检测H2O2作用