kisspeptin在牛卵母细胞体外成熟过程中的表达和功能研究

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1、分类号：S814.8.单位代码：10193密级：公开学号：2012573硕士学位论文Kisspeptin在牛卵母细胞体外成熟过程中的表达和功能研究ExpressionandFunctionofKisspeptinduringBovineOocyteMaturationinvitro作者姓名：贺明学位类别：农学硕士专业名称：动物遗传育种与繁殖研究方向：繁殖生物技术指导教师：吕文发所在学院：动物科学技术学院2015年5月独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容

2、外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允

3、许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月日摘要Kisspeptin是KiSS-1基因编码的一种多肽，其在下丘脑表达，对哺乳动物生殖活动起中枢调控作用已被广泛证实。研究表明，Kiss

4、peptin除在下丘脑表达外，在卵巢也有表达，但有关其功能和机制的研究极少。对猪和鼠的研究发现，Kisspeptin参与卵母细胞成熟，但其作用存在种属差异。牛卵母细胞上是否有Kisspeptin表达，其功能和机制如何，目前还不清楚。本文首先利用免疫荧光和荧光定量PCR技术研究了体外成熟过程Kisspeptin及其受体GPR54在牛卵母细胞中的分布定位及表达规律，随后研究了添加外源Kisspeptin对牛卵母细胞体外成熟的影响及其相关机制，研究结果主要分以下2部分：1.收集不同培养时间（0、6、12、18、24h）的牛卵母细胞进行免疫荧光染色，

5、随后于倒置荧光显微镜下观察。研究结果表明：Kisspeptin在卵母细胞整个体外成熟过程中均有表达，且表达位置相同。但由细胞的荧光强度可知，不同时间点的Kisspeptin表达量存在差异。收集不同培养时间（0、6、12、18、24h）的卵母细胞，利用荧光定量PCR，检测KiSS-1、GPR54基因表达量，研究结果表明，KiSS-1及GPR54基因的表达量均在0h最高，随体外培养过程出现波动性变化，且变化曲线较为相似。2.按照添加外源Kisspeptin的浓度不同将培养液分为5组，分别为TCM-199对照组、添加1nmol/L、10nmol/L

6、、102nmol/L、103nmol/LKisspeptin的处理组，用5种培养液进行卵母细胞体外培养并统计成熟率，成熟率最高组的Kisspeptin浓度为添加Kisspeptin的最适浓度。结果显示，添加10nmol/LKisspeptin组的细胞成熟率极显著高于其他4组（P<0.01），确定10nmol/L为添加外源Kisspeptin的最适浓度。按照培养液的不同处理方式将其分为8组，分别为①TCM-199②TCM-199+Kisspeptin③TCM-199+FSH④TCM-199+FSH+Kisspeptin⑤TCM-199+Kiss

7、peptin+FBS⑥TCM-199+FBS⑦TCM-199+Kisspeptin+p234⑧TCM-199+p234+FSH，用8种培养液进行卵母细胞体外培养并统计成熟率。结果显示，Kisspeptin组与Kisspeptin+FSH组的卵母细胞成熟率较高，两组间差异不显著，但均极显著高于FBS组（P<0.01）；同时添加FBS和Kisspeptin时，成熟率较低，与Kisspeptin组差异极显著（P<0.01）；同时添加Kisspeptin和p234，成熟率显著低于Kisspeptin组（P<0.05）；同时添加FSH和p234，成熟率

8、与FSH组无显著差异。I利用荧光定量PCR检测体外成熟过程中（12、24h）卵母细胞发育关键基因BMP15和GDF9的表达量。结果显示，BMP15和GDF9在12、