线粒体功能与卵母细胞体外成熟、受精及发育潜能的关系研究

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1、温州医学院博士学位论文线粒体功能与卵母细胞体外成熟、受精及发育潜能的关系研究姓名：葛红山申请学位级别：博士专业：妇产科学指导教师：黄长江；董巧香2012-05线粒体功能与卵母细胞成熟、受精及发育潜能的关系研究中文摘要第一部分控制性超促排卵(COH)和体外成熟(IVM)过程对卵母细胞线粒体的功能与分布影响的研究目的过高的卵子损失率仍是当前人类辅助生殖技术(ART)所面临的最大问题。细胞质成熟是卵子正常受精和发育的关键，细胞质成熟不全或滞后于核的成熟被认为是ART周期卵子发育潜能低下的重要原因。在卵子成熟过程中，胞浆中线粒体发生了剧烈变化，正常的线粒体结构和功能状况是细胞

2、质成熟的标志。ART周期中，控制性超促排卵(COH)和卵子体外成熟(ⅣM)过程恰好与胞浆线粒体急剧变化的时期相重合。那么，COH和ⅣM这两个非生理性卵子成熟过程是否会对卵子线粒体的功能状况产生影响，进而干扰细胞质成熟进程?以及COH／WM过程对卵子线粒体功能状况的影响是否就是造成ART周期卵子高损失率或低发育潜能的重要原因?对此，本研究以小鼠为动物模型，模拟人类COH和IVM周期操作，通过分析成熟卵子线粒体的空间分布、DNA(mtDNA)拷贝数、氧化磷酸化(OxPHOS)功能，以及与线粒体功能密切相关的活性氧(ROS)水平和细胞骨架结构完整性，来评估非生理性COH／I

3、VM过程对线粒体的数量、功能、分布及卵子质量的影响，为探索人类ART周期卵子低发育潜能和高损失率的机制提供新的思路。方法将实验小鼠随机分为控制性超促排卵(COH)、体外成熟(ⅣM)和自然周期(NC)对照三个小组。小鼠COH和IVM培养过程尽量参照人ART周期中相应的操作方案。收集各组成熟卵子，分别检测mtDNA拷贝数、线粒体膜电位强度、ATP含量、线粒体分布、ROS水平及纺锤体与染色体结构正常率，以评估COH和IVM这两个常用ART方案对线粒体的功能状况和卵子质量的影响。留温州医学院博士学位论文结果1．在COH组和NC组卵子之间，除线粒体分布和ROS水平以外，所有其它

4、检测指标均存在着显著差异，即COH组卵子的平均mtDNA拷贝数、线粒体膜电位强度、ATP含量和纺锤体与染色体结构正常率均显著低于NC组卵子的相应指标(氏0．05)。2．在IVM组与NC组卵子之间，mtDNA拷贝数、ROS水平和纺锤体与染色体结构正常率存在着显著差异，即IVM组卵子mtDNA拷贝数和纺锤体与染色体结构的正常率显著低于NC组卵子的(P<0．05)，而IVM组的胞浆总ROS水平和线粒体特异性ROS水平显著高于NC组的(氏O．05)。线粒体膜电位、ATP含量和线粒体分布在IVM组与NC组之间，无显著意义的差另aJ(P>O．05)。结论1．非生理性COH和ⅣM过

5、程可显著影响卵子线粒体的功能，以及与之密切相关的ROS水平和纺锤体／染色体结构，继而可能影响卵子细胞质的成熟进程。2．外源Gn刺激会显著降低COH组卵子的mtDNA的拷贝数、线粒体膜电位强度、ATP含量和纺锤体／染色体结构正常率。3．ⅣM过程会显著降低卵子的mtDNA拷贝数和纺锤体／染色体结构正常率，并且还会显著增加ROS的生成。但IVM过程对线粒体膜电位强度和ATP含量没有显著意义的影响。4．需要进一步的研究以分析线粒体功能状况影响卵子成熟、受精和发育的具体效应和机制。关键词：卵子：控制性超促排卵；体外成熟培养；线粒体功能状况；卵子质量留温州医学院博士学位论文第二部

6、分卵母细胞成熟过程中线粒体的氧化磷酸化和DNA复制功能对卵母细胞质量及发育潜能影响的研究在卵母细胞成熟过程中，胞浆中线粒体发生了剧烈变化，而线粒体的功能被证实与卵母细胞的成熟、受精和发育潜能密切相关。但迄今为止，对于线粒体是以何种机制影响卵母细胞的质量和发育潜能仍存在着争议。有研究认为，线粒体的数量或DNA(mtDNA)拷贝数是影响卵母细胞成熟、受精和发育潜能的关键；另有研究则认为，氧化磷酸化(OXPHOS)功能才是线粒体影响卵母细胞成熟、受精和胚胎发育潜能的主要机制。目的在卵母细胞成熟过程中，采用独立的线粒体功能抑制剂分别抑制线粒体的OXPHOS功能和DNA复制功能

7、，建立线粒体功能抑制模型，分析线粒体功能抑制对卵母细胞成熟、质量、受精和发育潜能的影响，以明确线粒体对卵母细胞的影响的机制。方法在小鼠体外成熟培养液中引入不同浓度的羰基氰4．(三氟甲氧基)苯腙(FCCP，10和100nM)或2’，3’-双脱氧胞苷(ddC，10和100pM)，分别抑制线粒体的OXPHOS功能和DNA复制功能。经体外14小时成熟培养，收集卵母细胞，检测各组成熟卵母细胞的mtDNA拷贝数、线粒体膜电位强度和ATP含量，以评估FCCP和ddC线粒体功能抑制模型的效果。统计卵母细胞的生发泡破裂(GVBD)发生率和细胞核成熟率，分析线粒体功能抑