ghrelin对体外牛卵丘细胞增殖和卵母细胞成熟影响的研究

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1、分类号S852.1学校代码10129UDC577学号2010301018Ghrelin对体外牛卵丘细胞增殖和卵母细胞成熟影响的研究EffectsofGhrelinontheBovineCumulusProliferationandOocytesMaturationinVitro申请人：米焱学科门类：农学学科专业：基础兽医学研究方向：动物组织胚胎与发育生物学指导教师：曹贵方教授李海军副教授论文提交日期：二〇一三年六月摘要哺乳动物中，Ghrelin被发现是一种协调能量和生殖活动平衡的促进食欲的胃肠激素，是生长激素促分泌物受体（

2、Growthhormonesecretagoguereceptor，GHS-R）的内源性配体，主要在胃组织内分泌细胞中分布。近年，在生殖系统中发现Ghrelin的高表达，有力的证明Ghrelin在生殖系统中有着比较重要的位置。卵母细胞的成熟与发育是哺乳动物进行体外受精及胚胎发育的先决条件，但是，卵母细胞成熟过程受到多重因素的影响。Ghrelin作为近年发现的新型激素，在一定程度上影响着生殖系统。因此，探索Ghrelin在卵母细胞成熟过程中的潜在作用对于促进体外受精等相关胚胎工程技术的发展和应用有着重要的理论与实践指导意义。

3、研究表明Ghrelin和GHS-R主要在卵巢具有分泌类固醇的黄体细胞和间隙细胞中表达，在卵母细胞中也有Ghrelin和其受体的表达。而且Ghrelin在体外刺激颗粒细胞增殖和抑制其凋亡而促进卵泡发育，并且抑制卵母细胞成熟。Ghrelin是否参与牛卵母细胞成熟，是否可以促进牛卵丘细胞增殖，未见报道。本研究以牛卵丘卵母细胞复合体（COCs）为研究对象，运用免疫荧光染色和激光共聚焦扫描技术、荧光定量RT-PCR、细胞增殖活性检测和WesternBlotting等方法对体外成熟过程中Ghrelin和GHS-R1a在牛卵母细胞和卵丘

4、细胞中的表达情况进行研3究，并在体外培养条件下，添加Ghrelin和其受体抑制剂（[D-Lys]-GHRP-6），观察其对卵母细胞成熟和卵丘细胞增殖的影响。结果如下：1.Ghrelin蛋白在牛卵母细胞胞质中表达，而GHS-R蛋白则特异性的定位于卵母细胞膜表面，在卵丘细胞中均有Ghrelin和GHS-R蛋白表达。2.体外成熟过程中卵母细胞Ghrelin和GHS-R1amRNA相对表达量随着成熟进程显著下降；卵丘细胞中，GhrelinmRNA表达量随着成熟时间在8h显著增加然后在16h显著下降，而GHS-R1amRNA表达量随

5、着成熟时间逐渐增加。3.FSH抑制卵母细胞Ghrelin和GHS-R1amRNA表达，而FSH显著促进卵丘细胞Ghrelin和GHS-R1amRNA表达；FSHBI解除FSH对卵母细胞Ghrelin和GHS-R1amRNA表达的抑制作用和FSH对卵丘细胞Ghrelin和GHS-R1amRNA表达的促进作用。4.Ghrelin和FSH显著促进卵丘细胞表达PCNA和BCL-2mRNA，而3[D-Lys]-GHRP-6的添加促使PCNA和BCL-2mRNA水平显著降低（P<0.05）；3[D-Lys]-GHRP-6和FSH对凋亡

6、基因BAXmRNA的表达无作用，Ghrelin显著抑3制BAXmRNA的表达，[D-Lys]-GHRP-6解除Ghrelin对BAX表达的抑制作用（P<0.05）。35.Ghrelin刺激卵丘细胞PCNA蛋白表达，而[D-Lys]-GHRP-6抑制Ghrelin对PCNA表达的促进作用。36.Ghrelin和FSH明显促进卵丘细胞增殖活性，[D-Lys]-GHRP-6抑制卵丘3细胞活性增加（P<0.05），而且[D-Lys]-GHRP-6抑制Ghrelin和FSH促进卵丘细胞增殖活性的增加。7.Ghrelin抑制卵母细胞B

7、MP15和GDF9mRNA表达，以及卵母细胞GVBD3发生率，而这种作用被[D-Lys]-GHRP-6解除。关键词：牛；卵母细胞；卵丘细胞；免疫荧光染色；实时荧光定量RT-PCR；细胞增殖活性；Westernblotting；GVBDEffectsofGhrelinonBovineCumulusProliferationandOocyteMaturationinvitroAbstractGhrelinistheorexigenicguthormonethathasbeenputforwardtoregulatethebal

8、ancebetweenenergyandreproductioninmammals,andistheendogenousligandofgrowthhormonesecretionreceptor(GHS-R),distributioninendocrinecellsofgastrictissue.In