ag85b和19kda信号肽介导bvdv e_0-e_2融合基因在rbcg中的表达及其免疫原性分析

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1、分类号:S858.92单位代码：10193密级：无学号：2012620硕士学位论文Ag85B和19kDa信号肽介导BVDVE0-E2融合基因在rBCG中的表达及其免疫原性分析Ag85Band19kDasignalpeptidemediatedBovineViralDiarrheaVirusE0-E2fusiongeneexpressionandImmunogenicityvalidationinrecombinantBCG作者姓名：孙凡婷学位类别：农学硕士专业名称：预防兽医学研究方向：经济动物疫病学指导教师：杜锐所在学院：动物科学技术学院2015年5

2、月独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的

3、论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月摘要牛病毒性腹泻病毒（Bo

4、vineviraldiarrheavirus，BVDV）为黄病毒科（Flaviviridae），瘟病毒属（Pestivirus）成员，是牛病毒性腹泻-黏膜病的病原，其临床表现为，病畜发热、腹泻、怀孕母畜流产或产畸形胎、持续感染等。E0、E2蛋白为BVDV主要的保护性抗原，能够刺激机体产生中和BVDV的抗体，成为研究BVDV基因工程亚单位疫苗的候选蛋白。信号肽在介导蛋白质分泌表达与抗原递呈途径方面具有重要的作用。目前，应用的结核分枝杆菌信号肽主要有Ag85B蛋白和19kDa脂蛋白。本研究中同时选择Ag85B蛋白和19kDa脂蛋白信号肽介导E0、E2在重

5、组卡介苗中表达。本实验应用重叠延伸剪接技术将Ag85B蛋白和19kDa脂蛋白信号肽基因分别与C24V标准株的E0截短基因、changchun184株的E2截短基因、E0-E2融合基因进行拼接，将融合基因与穿梭表达载体pMV261连接，将重组表达质粒电转至卡介苗中构建重组卡介苗，将筛选的阳性重组卡介苗，在45℃条件下热诱导目的基因的表达，进行SDS-PAGE和Westernblot检测。将构建的重组卡介苗免疫小鼠，分别检测血清中BVDV和BCG抗体水平、IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-12水平，以及脾脏中CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚

6、群含量、淋巴细胞增殖情况，进而对rBCG的免疫效果进行评价。研究成功构建了六个重组卡介苗，分别为rBCG-Ag85B-E0、rBCG-19kDa-E0、rBCG-Ag85B-E2、rBCG-19kDa-E2、rBCG-Ag85B-E0-E2和rBCG-19kDa-E0-E2。对构建的rBCG进行SDS-PAGE，结果显示信号肽诱导的rBCG产生的蛋白主要集中在沉淀中。将rBCG免疫小鼠后，免疫小鼠的血清中BVDV抗体水平均有不同程度的升高，在42d时，rBCG组中rBCG-19kDa-E2组血清中抗体水平要显著高于其他各组。IFN-γ、IL-4、IL

7、-10和IL-12细胞因子的水平在免疫期间均呈现上升趋势，且IFN-γ的含量水平在所测得的细胞因子中具有显著的优势，因此表明所构建的rBCG主要诱导Th1型细胞免疫应答。在CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群含量测定中，CD4+细胞所占的比例约为%具有主导优势的，而19kD诱导的重组卡介苗产生的CD8+T淋巴细胞亚群含量水平较高。研究结果表明构建的重组卡介苗在一定程度上诱导机体产生体液免疫和Th1型细胞免疫应答反应，且引入19kDa信号肽序列提高可重组卡介苗的免疫效果。本研究证实了信号肽介导的重组卡介苗可增强其免疫效果，其中19kDa信号肽介导

8、的表达E2基因的重组卡介苗免疫效果好于其他组别，可作为BVDV新型疫苗的候选疫苗。关键词：重组卡介苗，牛病毒