黄芪注射液联合恩替卡韦抗乙型肝炎病毒感染机理研究

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1、分类号R512.6+2学校代号10572UDC610密级公开学号20122113125广州中医药大学GuangzhouUniversityofChineseMedicine博士学位论文黄芪注射液联合恩替卡韦抗乙型肝炎病毒感染机理研究学位申请人严景妍指导教师姓名王新华专业名称中医临床基础申请学位类型科学学位论文提交日期2015年6月广州中医药大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经特别加以注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体

2、，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名日期：年月日关于学位论文使用授权的声明本人完全了解广州中医药大学有关保留使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。本人授权广州中医药大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。（保密论文在解密后应遵守此规定）论文作者签名论文导师签名日期：年月日摘要目的：通过体内外实验研究黄芪注射液联合恩替卡韦抗乙型肝炎病毒感染的作用和机理。方法：1.黄芪注射液联合恩替卡韦抗

3、乙型肝炎病毒感染雏鸭体内实验研究。筛选感染鸭乙型肝炎病毒的一日龄，重约50克/只的雄性龙岩麻鸭48只，随机分为病毒对照组，恩替卡韦治疗组（0.1mg/kg），黄芪注射液高、中、低剂量（20ml/kg、10ml/kg、5ml/kg）联合恩替卡韦治疗组及单用黄芪注射液高剂量治疗组（20ml/kg）6个实验组，每组8只动物。于治疗前（T0），治疗7天（T7），治疗14天（T14），治疗21天（T21），停药5天（P5），停药10天（P10），停药20天（P20）测定病毒含量并进行比较。2．黄芪注射液联合恩替卡韦抗乙型肝炎病毒感染HepG2.2.15细胞体外实验研究。培养Hep

4、G2.2.15细胞，将细胞分为病毒对照组，恩替卡韦治疗组（30nmol/L），黄芪注射液高、中、低剂量联合恩替卡韦治疗组和黄芪注射液高、中、低剂量治疗组(1000ng/ml、500ng/ml和250ng/ml)共8个实验组，每组设9个复孔，用CCK8比色法检测用药组细胞的增殖情况。分别于用药第3天（T3），停药第3天（P3），用PCR荧光探针方法检测各组细胞上清和细胞内HBVDNA。3.黄芪注射液联合恩替卡韦抗乙型肝炎病毒感染机理研究之HepG2和HepG2.2.15细胞体外实验研究。培养HepG2细胞和HepG2.2.15细胞。将未转染乙肝病毒的HepG2细胞作为空白

5、对照组细胞，转染了乙肝病毒的HepG2.2.15细胞作为用药组和病毒对照组细胞，将细胞分为空白组，恩替卡韦治疗组（30nmol/L），黄芪注射液高、中、低剂量联合恩替卡韦治疗组和黄芪注射液高、中、低剂量治疗组（1000ng/ml、500ng/ml和250ng/ml），病毒对照组共9个实验组，每组设6个复孔。用药培养3天，将其中每组3个复孔细胞消化、裂解等处理后，应用荧光定量PCR方法检测药物对HepG2.2.15细胞JAK-STAT通路信号mRNA的影响，另3个复孔细胞消化、裂解等处理后，用蛋白免疫印迹（WesternBlotting）方法检测药物对细胞内NF-κB、O

6、AS、PKR、Caspase3蛋白的影响。4．黄芪注射液联合恩替卡韦对刀豆蛋白ConA造成的NIH小鼠免疫性肝损伤实验研究。购买72只雄性NIH小鼠，随机分为正常对照组，恩替卡韦治疗组（45μg/kg），黄芪注射液高、中、低剂量联合恩替卡韦治疗组，黄芪注射液高、中、低剂量治疗组（1.5、1、0.5ml/10g），模型对照组，9个实验组，每组8只动物。除正常对照组外,其余小鼠尾静脉注射ConA20mg/kg后，分别于首日上、下午和次日下午各灌胃给药一次，末次给药后4h，模型组和各给药组小鼠一次性静脉注射ConA20mg/kg，禁食、不I禁水，8h后摘小鼠眼球取血，离心分离

7、血浆。测血浆中ALT、IFN-γ、TNF-α、SOD、MDA、NO，统计给药前和给药之后的变化。测各组小鼠的肝脏、脾脏、胸腺系数均值并进行对比，取肝左叶组织,10%甲醛溶液固定，电镜下观察病理切片组织结构的改变。随机取每组3只小鼠除肝左叶以外的剩余肝脏100mg，研磨、裂解等处理后应用蛋白免疫印迹（WesternBlotting）方法观察各组肝细胞内NF-κB、OAS、PKR、Caspase3蛋白的变化。结果：1.黄芪注射液联合恩替卡韦抗乙型肝炎病毒感染雏鸭体内实验研究。本次实验病毒对照组动物血清DHBV-DNA水平稳定；黄芪注射液联合恩