猪fcεri的分子特征及其在prrsv感染中的致炎调节作用

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1、猪FcεRI的分子特征及其在PRRSV感染中的致炎调节作用MolecularCharacteristicsandtheInflammtoryRegulationRolesofPorcineFcεRIonPRRSVInfection学科专业：生物学作者姓名：沈梦露指导教师：黄金海教授天津大学生命科学学院二零一七年五月万方数据独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得

2、天津大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津大学有关保留、使用学位论文的规定。特授权天津大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。（保密的学位论文在解密后适用本授权说明）学位论文作者签名：导师签名：签字日期：

3、年月日签字日期：年月日万方数据摘要猪繁殖与呼吸综合症（PorcineReproductiveandRespiratorySyndrome，PRRS），是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PorcineReproductiveandRespiratory[1]SyndromeVirus，PRRSV）所引发的一种烈性传染病。其特有的免疫逃逸机制，也为其防治带来了巨大的困难。IgE及其受体FcεR的活化是导致I型过敏反应的主要原因。IgE的受体FcεR主要有2类，一类为高亲和力受体，即FcεRI，另一类为低亲和

4、力受体即FcεRII（CD23）。PRRSV感染后引起机体迅速的毛细血管内凝血（DIC），导致“蓝耳红皮”等特有的炎症病变现象，与I型过敏反应导致的结果类似。目前关于猪IgE及其受体FcεRI与PRRSV致炎的关系尚不清楚。本研究拟了解猪FcεRI及其在主要靶细胞——猪肺泡巨噬细胞上的表达情况，探究PRRSV感染引起的特征性的病理变化，对靶细胞上IgE受体表达的影响，了解IgE受体在PRRSV感染中的作用。（1）FcεRI分子的克隆及分析：从猪的肺泡巨噬细胞成功克隆了猪FcεRI，测序结果表明，克

5、隆基因与已登陆Genbank的序列同源性在99%以上。在PK-15、PBMC等其他猪源传代细胞系未检测到FcεRI基因。将克隆的序列与其他物种的FcεRI进行氨基酸序列比对和进化树分析，发现物种间的差异较大，其与长臂猿的相似性最大，也仅有10.1%，表明猪FcεRI在结构及其生物学功能上可能具有特殊性；分析了两类FcεR信号肽、跨膜区、糖基化位点、磷酸化位点、抗原决定簇等，发现FcεRI含有两个免疫球蛋白结构域，而FcεRII不属于免疫球蛋白超家族，其含有C型凝集素识别结构域。两类FcεR均含有多

6、个磷酸化位点、糖基化位点和抗原决定簇，这些结构特征与其功能密不可分，也为进一步研究其信号传导提供铺垫。（2）FcεRI分子的表达及抗体制备：构建了FcεRI的原核表达载体，转化大肠杆菌，经诱导表达、纯化获得了较高纯度的FcεRI蛋白；家兔免疫制备了多克隆抗体。利用间接ELISA测定FcεRI多克隆抗体效价为1：12800。通过Westernblot和免疫荧光实验验证FcεRI多抗与细胞上FcεRI分子具有良好的反应性。（3）FcεRI在PRRSV感染中的作用：研究了有无PRRSV抗体参与情况下，巨

7、噬细胞上FcR的表达变化。PRRSV、PRRSV-抗体结合物分别感染3D4/21细胞，发现在PRRSV-ADE效应下，FcγII、FcεRI的转录水平明显上调，而PRRSV单独感染时FcεRI无明显变化，推测FcεRI可能参与了PRRSV-ADE效应。通过，在易感和不易感的细胞系中，分别过表达FcεRI，发现在PRRSV-ADE效应下，I万方数据FcεRI促进了PRRSV的内化和增殖。转录组学和荧光定量PCR检测结果表明FcεRI参与了PRRSV感染中抗原提呈和炎性因子的调控；在ADE效应下，PR

8、RSV感染细胞，FcεRI途径介导的信号分子p38、PI3K，细胞表达的趋化因子CCR2、MCP-1等明显下调。但参与炎症调节的Vav、Akt、PLA2等分子的转录水平明显上升，IL-1RA、IL-2、TGF-β等抗炎性细胞因子明显下调，证明在FcεRI与PRRSV感染致炎症作用密切相关。综上研究表明，猪FcεRI在序列及结构上具有一定的特殊性；FcεRI在PRRSV感染致炎症反应中具有重要作用，表现为有无PRRSV抗体下差异的转录表达特征，促进了PRRSV及抗体复合物进入细胞，影