重组猪肺表面活性蛋白a在体外抑制prrsv感染宿主细胞的研究

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1、河北农业大学硕士学位论文重组猪肺表面活性蛋白A在体外抑制PRRSV感染宿主细胞的研究姓名：张峰申请学位级别：硕士专业：基础兽医学指导教师：崔亚利；仲飞20120531摘要lMIIIIIIIIIIIIILtMIILIIIIIIIIIILt(111IIIIY2143267猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的妊娠母猪发热流产，仔猪与育肥猪呼吸障碍为特征的传染病，是目前危害养猪业最为严重的传染病之一，给我国的养猪业带来了巨大的经济损失。国

2、内外学者已经对PRRS进行了大量的研究，对其致病机理等方面有了深入的了解。PRRSV是RNA病毒，感染的主要途径为呼吸道，其宿主细胞为猪肺泡巨噬细胞(PorcineAlveolarmacrophage，PAM)，病毒在不同亲代之间变异较大。由于没有有效的疫苗控制病毒的感染，所以动物体的天然免疫系统对该病毒的抵御作用显得异常重要。天然免疫系统不仅能及时清除外来的病毒，同时也可促进或激活机体的获得性免疫系统。已有研究表明，SP．A分子中含有能够识别病毒表面多糖分子的结构域，具有一定的抗病毒作用。所以在目前尚无有效的PRRS疫苗的情况下，通过研究SP．A抗P

3、RRSV感染宿主细胞的作用，从先天性免疫方面为抗PRRSV感染的研究提供了新的途径。因此，为研究SP．A是否具有抗PRRSV感染宿主细胞的活性，我们制备了重组猪SP．A蛋白，并在体外进行了与PRRSV相互作用的研究。本实验首先采用PCR方法从含有猪SP。A基因的质粒中扩增SP—A基因，并将其插入到含有人CD5信号肽序列的真核表达载体pcDNA3．1A．CD5中，构建成SP．A基因的真核分泌型表达载体pcDNA3．1-CD5．SPA／MH。将重组表达载体通过磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行瞬时表达，通过Westernblot方法鉴定表达产物，采用Ni

4、．NTA琼脂糖凝胶亲和层析法从培养基中分离和纯化重组SP．A蛋白，通过ELISA方法检测SP．A蛋白与PRRSV的结合活性。将SP．A蛋白与PRRSV孵育，然后感染MARC．145细胞和猪肺泡巨噬细胞，感染72h后测定病毒滴度，分析重组猪sP．A蛋白对PRRSV感染的抑制作用。结果表明构建的真核表达载体能够介导SP．A基因在HEK293T细胞中进行分泌表达；表达的重组猪SP．A蛋白能够与PRRSV进行剂量依赖性结合；用重组猪SP—A蛋白与PRRSV进行孵育，然后感染MARC-145细胞和猪肺泡巨噬细胞，结果显示SP．A处理的PRRSV感染细胞后的病变程

5、度显著低于对照组。感染72h后，SP．A处理组的PRRSV在MARC．145细胞和PAM细胞的滴度显著低于SP．A非处理组。综上所述，可以得出以下结论：重组猪SP．A蛋白在体外对PRRSV的感染有显著的抑制作用，具有抗PRRSV的活性。关键词：猪肺表面活性蛋白A；抗病毒活性；猪繁殖与呼吸综合征病毒；真核表达StudyoninhibitingPRRSVinfectionintohostcellsinvitroofrecombinantporcinelungsurfactantproteinAGraduateStudent：ZhangFengAdvisor

6、：Prof．CuiYali，Prof．ZhongFeiMajor：BasicVeterinaryMedicineAbstractPorcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)causedbyPRRSvirUS(PRRSV)iSoneofthemostseriousinfectiousdiseasesofswine．ItmayleadtopregnantSOWS’feverandabortion，andtherespiratoryproblemsofpiglets．Ithasbroughthugeecono

7、miclossestoChina’Spigindustry．BothdomesticandabroadscholarshavedonealotofresearchonPRRS．andtheyhaveadeeplyrecognizeaboutthepathogenesisofPRRS．PRRSVwasdefinedasRNA’virus．ThemainwayofPRRSV’SinfectioniSrespiratorytract．andthehostcellsofPRRSVareporcinealveolarmacrophages．AndPRRSVhav

8、egreatvailationbetweendifferentparentals．Becaus