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分类号河南农业大学硕士学位论文密级学位申请人：扬壹厦导师：夏壬窒专业：亟随兽医堂研究方向：动物坌壬痘壹堂皇佥壬鱼瘗堂论文提交日期：学位授予日期： 河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书学位论学位文题目激活型FcTRs在PRRSV感染中的作用农学硕士级别学生杨青原学科导师姓名专业预防兽医学夏平安姓名学位论文九如需保密，解密时间年月同是否保密独创性声明本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。特此声明。一虢撇翩签名锄同期：2013年月同f=t期：2013年月同学位论文使用授权及知识产权归属承诺本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷本和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。本人完全了解《河南农业大学知识产权保护办法》的有关规定，在毕业离开河南农业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第一署名单位为河南农业大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农业大学所有，否则，承担相应的法律责任。注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。髋蝼名蛳师擗锄鞴册戳：同期：2013年月同日期：4013年月同同期：2013年月同 致谢光阴荏苒，硕士研究生的学习即将结束，三年的学习生活使我受益匪浅。经历大半年时间的磨砺，硕士毕业论文终于完稿，回首大半年来收集、整理、思索、停滞、修改直至最终完成的过程，我得到了许多的关怀和帮助，现在要向他们表达我最诚挚的谢意。本论文是在导师夏平安教授和崔保安教授的悉心指导下完成的，在此衷心感谢导师在研究方向、论文选题、试验过程和论文撰写等方面给予的指导和支持。导师严谨的治学态度、渊博的专业知识、创新求实的科研精神、前瞻的科学思维一直引导并鼓励我前进，使我受益终身；导师慎密的科研思维、坚韧的科研态度、忘我的工作精神、朴实的生活作风是我永远学习的典范和努力的方向!谨向恩师致以最崇高的敬意和最衷心的感谢!首先，我要深深感谢我的导师夏平安老师。夏老师为人谦和，平易近人。在论文的选题、搜集资料和写作阶段，夏平安老师都倾注了极大的关怀和鼓励。在论文的写作过程中，每当我有所疑问，夏老师总会放下繁忙的工作，不厌其烦地指点我；在我初稿完成之后，夏老师又在百忙之中抽出空来对我的论文认真的批改，字字句句把关，提出许多中肯的指导意见，使我在研究和写作过程中不致迷失方向。他严谨的治学之风和对事业的孜孜追求将影响和激励我的一生，他对我的关心和教诲我更将永远铭记。借此机会，我谨向夏老师致以深深地谢意。衷心感谢导师组张改平院士、王川庆教授、宁长申教授、张龙现教授、许兰菊教授、陈红英教授、宋长绪研究员、李文刚教授、王亚宾副教授、陈丽颖副教授、张红英副教授、李新生副教授、魏战勇副教授、王学斌副教授、王彦彬副教授、张光辉副教授、陈陆副教授、杨霞副教授、菅复春副教授、杨明儿老师、胡慧老师、金钺老师、史西宝老师、郅玉宝老师在完成学习任务和课题研究中对我的指导、帮助和大力支持!衷，15,感谢师兄张志远、周永辉、张继希、张祥和师姐刘肖萍、段二珍、卢晓燕、张宜娜在试验过程中给予的帮助和指导!衷心感谢三年来一直相互帮助、相互鼓励、一起探讨、共同进步的李晓波、穆春龙等牧医工程学院2010级全体研究生!有他们相伴，我的试验课题才能顺利的完成!衷，15,感谢师弟秦运杰、刘肖、张留军和师妹李英英、绍刘云、李娜、杜东颖、王冬梅对试验顺利进行提供的大力帮助!衷，15,感谢院党总支、院办公室、院团委的各位领导和老师对我的鼓励和支持! 感谢河南农业大学为我的成长和学习提供的优美环境和良好平台!再次衷心的感谢曾经给予我指导和帮助的全体老师!特别感谢辛勤抚育我成长，鼎力支持我学习的父母及亲人!感恩父母谨慎的牵着线却又给我自由的发展空间!感谢在生活上给予我支持的亲朋好友，有他们的鼎力帮助我刁‘能顺利的完成学业!最后，真心感谢所有引导我、帮助我、陪伴我成长的人! 目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1英文缩略词⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4IgGFc受体研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4PRRSV研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．10引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l5试验一抗体在PRRSV感染PAM中的作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．161材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯162方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯173结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯194讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯22试验二FcTRI的选择性激活在PRRSV感染的免疫反应中的作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．25l材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯252方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯263结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯284讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯33试验三FcTRIIII；内选择性激活在PRRSV感染的免疫反应中的作川⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．351材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯352方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯363结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯434讨{念⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯44全文总结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．45参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．46英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．56发表文章⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．59 河南农业大学2013届硕士研究生学位论文中文摘要猪繁殖与呼吸综合征(PorcineReproductiveandRespiratorySyndrome，PRRs)是由猪繁殖与呼吸综合征(PorcineReproductiveandRespiratorySyndromevirus，PRRSV)：SI起的以妊娠母猪繁殖功能障碍以及不同年龄阶段猪呼吸道症状为特征的病毒性传染病。主要侵害肺泡巨噬细胞和单核细胞。PRRSV存在持续性感染、免疫抑制、抗体依赖增强作用(ADE)等免疫特征。PRRSV感染ADE是通过IgGFc受体(FcTR)介导的内吞作用促进病毒进A．E噬细胞复制。FcTR是一类能够特异亲和免疫球蛋白lgGFc片段的细胞表面分子，lgGFc受体的表达能够触发和调=侮多种免疫学效应，在机体免疫防御中起着极其关键的作川。猪igGFc受体主要有FcTRI(CD64)，FcTRII(CD32)、FcTRIII(CDl6)Z类分子组成。其中FcTRI、FcTRIII是激活型FcTR，激活型受体主要是通过胞内域的ITAM基序或FcR-),传递活化信号，诱导免疫反应。本研究通过探讨激活型FcTR(FcTRI和FcTRIII)在PRRSV感染的免疫反应中的作用以及不同的抗体在PRRSV感染PAM中的作用，为该病的防治和新型疫苗研发奠定基础。本研究分别将抗PRRS特异性lgG(2．64mg／m1)矛lltt特异性lgG(2．63mg／m1)作倍比稀释，与等体积含200TCID50／100pL的PRRSVHn．I／06株病毒液混合，制备成一系列的感染性免疫复合物(PRRSV．IgG)和阴性抗体一病毒混合液(PRRSV+IgG)，接种PAM细胞；同时将纯化的猪阴性IgG(2．63mg／m1)和兔抗猪lgG(2．64mg／m1)等体积混合制备免疫复合物(IC)，分别与等体积含200TCID50／100乩的PRRSVHn一I／06株病毒液混合，制备成非感染性免疫复合物．病毒混合液(PRRSV+IC)，接种PAM细胞。接种24h后川实时荧光定量PCR方法检测PRRSV的mRNA水平。同样的方法，分别将2倍稀释的PRRSV-IgG，PRRSV+IgG和4倍稀释的PRRSV+IC接种PAM细胞；将纯化FcTRIIBlgG(550ug／m1)处理PAM细胞，制备的感染性免疫复合物和非感性免疫复合物处理PAM细胞，州实时荧光定量PCR方法分别检测感染12、24、36和48h后不同时间段内PRRSV的mRNA水平。结果显示，一定浓度的PRRS特异性Ⅱ中和水平抗体，在感染48h时间段内均能极显著促进PRRSV在PAM细胞中增殖；而适当剂量的免疫复合物，在感染48h时间段内也均能促进PRRSV在PAM细胞中增殖。PRRS特异性Ⅱ中和水平抗体和非感性免疫复合物在FcTRIIB被封闭的情况下均能显著的促进病毒增殖。结果表明，一定浓度的PRRS特异性亚中和水平抗体通过激活型FcYR途径增强PRRSV在宿主细胞中的增殖；一定浓度的PRRS非特异性抗体及其形成的非感染性免疫复合物均通过激活型FcTR途径增强PRRSV在宿主细胞中的增殖。本研究采用将含有200个TCID50的Hn．2／06PRRSV、脂多糖(100ng／mL)、鼠阴性lgG(SS01ag／m1)矛ll纯化鼠抗猪F吖RIIgG(550I．tg／m1)接种PAM细胞；同时用纯化鼠抗猪FcTRlIgG(550I．tg／m1)和鼠阴性lgG(550肛∥m1)处理PAM细胞后接种含有200个TCIDs0的Hn一2／06PRRSV，各组分别培养12h、24h、36h、48h、60h、72h后收集细胞及上清，同时设健康细胞对照组，用已经建立的绝对荧光定量PCR方法检测接毒组PAM细胞中不同时第1页共59页 河南农业人学2013届硕士研究生学位论文间段内PRRSV复制水平以及用相对荧光定量PCR检测各组PAM细胞中IFN．CL、TNF一0【mRNA转录水平。结果显示，Hn．2／06PRRSV在感染PAM细胞后12—24h期间PRRSV促进IFN．0【的mRNA水平，36．72h期间PRRSV抑制IFN—u的mRNA水平；TNF—amRNA水平在感染后12h．72h均下调；用纯化鼠抗猪FcTRIlgG处理猪PAM后，选择性激活猪PAM细胞表面FcTRI，数据显示IFN．0【、TNF一0【mRNA水平显著下调，猪FcTRl选择性激活能抑制宿主细胞的抗病毒因子水平；PRRSV感染中，选择性激活猪PAM细胞表面FcyRl后显著抑制抗病毒因子IFN一伍、TNF．u的转录水平，说明PRRSV感染过程中猪Fcl'RI选择性激活更进一步抑制了宿主细胞的抗病毒因子水平。本研究采用将含有200个TCID50的Hn一I／06PRRSV、脂多糖(100ng／mL)、鼠阴性lgG(5501ag／m1)矛ll纯化鼠抗猪FcTRIIIIgG(5501ag／m1)接种PAM细胞；同时川纯化鼠抗猪FcTRIIIIgG(550I．tg／m1)和鼠阴性IgG(550I_tg／m1)处理PAM细胞后接种含有200个TCID50的Hn．I／06PRRSV，各组分别培养l2h、24h、36h、48h、60h、72h后收集细胞及上清，同时设健康细胞对照组，用已经建立的绝对荧光定量PCR方法检测接毒组PAM细胞中不同时间段内PRRSV复制水平以及用相对荧光定量PCR检测各组PAM细胞中IFN—q、TNF．cLmRNA转录水平。结果显示，Hn．I／06PRRSV在感染PAM细胞后12．24h期间PRRSV促进IFN一0【的mRNA水平，36。60h期间PRRSV抑制IFN．0【的mRNA水平，之后IFN．Ⅱ的mRNA水平恢复正常；TNF—amRNA水平在感染后12h．72h均上调。J}{j纯化鼠抗猪FcTRIIIIgG处理猪PAM后，选择性激活猪PAM细胞表面FcTRIII，数据显示IFN一0【、TNF一13tmRNA水平显著下调，PRRSV感染中，选择性激活猪PAM细胞表面FerRIII后显著抑制抗病毒冈子IFN一0【、TNF．a的转录水平，说明PRRSV感染过程中猪FcyRIII选择性激活更进一步抑制了宿主细胞的抗病毒因子水平。关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；激活型FcTR；FcyRI；FcTRIII；抗病毒细胞因子；抗体依赖增强第2页共59页 河南农业大学2013届硕士研究生学位论文ADEAmpBp常用缩略词antibodydependentenhancementAmpicillinBasepairDMEMDulbecco’SModifiedEagleMediumDNADEPCHmRNAmLORFPAMPBSPCRPRRSDeosyr．bonucleotideacidDiethylpyrocarbonateHourMessageRNAMilliliterOpeningreadframepulmonaryalveolarmacrophage(s)PhosphatebuffersalinePolymerasechainreactionPorcineReproductiveandRespiratorySyndrome抗体依赖性增强作用氨苄青霉素碱基对DMEM培养基脱氧核糖核酸焦磷酸二乙脂小时信使RNA毫升开放阅读框肺泡巨噬细胞磷酸盐缓冲液聚合酶链式反应猪繁殖与呼吸综合征PRRSVPorcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus猪繁殖与呼吸综合征病毒RnaseRNARTLPSlFN—QTNF．aRibonucleaseR．bonucleotideReversetranscriptionLipopOlysaccharideInterferon—aTumorNecrosisFactor-Q第3页共59页RNA酶核糖核酸反转录脂多糖。干扰素肿瘤坏死因子一0【 河南农业大学2013届硕．}：研究生学位论文文献综述一IgGFc受体研究进展1IgGFc受体的研究概况lgGFc受体(Fcreceptor，FcR)是一类重要的免疫细胞表面分子，能够特异亲和免疫球蛋白(19)的Fc区域【1J，是非常重要的免疫细胞表面分子，在机体免疫防御中有很重要的作用，是细胞免疫和体液免疫的桥梁。主要表达丁NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞等【ZJ，介导免疫复合物与免疫细胞和其他细胞之间的相互作Hj，能够触发和凋控机体许多免疫细胞学生物效应，其中包括抗原加I：与提早、凋’协抗体生成、肿瘤细胞的裂解、清除免疫复合物、T细胞增殖与分化抗体依赖性细胞毒作川(Antibodydependentcytotoxicity，ADCC)等多种免疫细胞学生物效应，是细胞免疫和体液免疫联系枢纽13’4’5’6】。人们的研究发现Fc?Rs在免疫防御和自身免疫中起着重要作刚，在研究机体免疫性疾病t71(如系统性红斑狼疮，SystemicLupusErythematosus，SLE)、传染病、过敏等疾病和肿瘤中起重要作用【8，9，101。但是对动物的Fc?Rs的研究相对比较滞后，但是近年来许多家畜Fc?Rs基因序列先后被克隆，对动物FcyRs研究也取得了很大的进步，但是对FcTRs基因定位、生物学功能及等调控表达机理等方面研究不够深入，仍需加强更进一步研究。1．1Fc受体的分类与命名在FcR研究中发现，人多数FcRs都属丁．免疫球蛋白超家族基因，其中只有Fc￡RII与C型凝集素有关，FcRs胞外域的lg样结构域具有高度的同源性，但它们在胞内域、配体特异性及生物学功能、细胞分布等许多方面都存在很人的差异。根据他们各自的生物学功能不同可分为两大类：一类位于表达丁．免疫效应细胞的表面，能够结合抗原。抗体复合物，触发和调控多种免疫学反应，按FcRs配体特性不同可将其分JulgG受体(FcTR)、lgA受体(FcctR)、lgM受体(FcI．tR)、IgD受体(FcSR)矛IIIgE受体(FccR)；另一类是负责Ig转运受体((neonatalFcR，FcRn)和多聚Ig受体(polymericimmunoglobulinreceptor，plgR)，它们负责转运免疫球蛋白通过上皮细胞表面，使IgG降解数量降低⋯'121。根据Fc?R胞内区的特征可将其分为两人类：激活型受体(Activatingrecept00齐ll抑制型受(Inhibitoryreceptor)113,141，他们共表达丁．巨噬细胞、单核细胞等免疫细胞表面，共同调：仃抗体对免疫细胞的生物学作用【l5|。激活耍'．J．FcyR受体的胞内区FcR-?链(FcERI，FcctRI，FcTRI，boFcT2R，Fc?RIII，)或者FcTR11A，这些激活型受体胞内区都含共同的酪氨酸的受体活化基序(ImmunoreceptorTyrosine—basedActivationMotif，ITAM)，免疫效应细胞被ITAM激活，诱导补体依赖细胞毒作川(complement—dependentcellularcytotoxicity，CDCC)、抗体依赖细胞毒作用(antibody-dependentcellularcytotoxicity，ADCC)、细胞的吞噬作用(phagocytosis)、细胞裂解(cytolysis)、调节淋巴细胞增殖与分化分泌和细胞因子及其它炎性因子等多种细胞免疫学效应。而FcYRIIB是目前发现的唯一的一个抑制型Fc受体，其胞内区第4页共59页 河南农业大学2013届硕二E研究生学位论文包含与其他受体不用的基序酪氨酸的受体抑制基序(immunoreceptortyrosine．basedinhibitorymotif，ITIM)，它能够通过抗体免疫复合物与激活型Fc^rR受体交联，抑制其胞内区酪氨酸的受体活化基序，进一步抑制细胞活化，抑制信号传导‘2～1。按照以下规则对FcR进行标准命名，受体的物种来源用表示受体字母前面的两个小写字母表示，如mo代表小鼠bo代表牛、hu代表人等；小写的希腊字母代表不同种类的Ig相对应I；『qFcR，即Fc￡R为lgE，FcTR的配体奠JIgG，Fc“R为lgM，FcaR奠JlgA，用罗'--3数字区别在结构上存在有明显差异的同种FcR(女nFcTRIV、FcTRIII、FcTRII和Fc^rRl)；用A、B、C表示结构相似但基因来源1二不同而的FcR，刚人写字母表示等位基冈(如huFcTRIIALR币IJhuFcTRIIAHR)：FcR受体不同转录体的同一基冈通常川al、a2、bl、b2等表示；FcR弧单位F用最后的小写希腊字母则代表，例女【1FcTRIIIA丫、Fcl,RIIIAc【等⋯。目前已鉴定的Fc?Rs有Fc丫RI、Fcl,RII、FcTRIII、boF吖2R和moFc丫RIV五种类型。1．2lgGFc受体亚类的生物学特性及家畜FcTRs研究进展1．2．1FeTRI(CD641FcyRI(CD64)是激活型Fc一、／R，分子量为70kD左右，是一种由3个lg样胞外区、跨膜区和胞内区构成I型跨膜糖蛋白，FcTRI主要表达于树突状细胞单核细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞等多种免疫细胞，大量资料研究显示表达较高是在巨噬细胞和单核细胞中【16】。Fc^rRI是高亲和力能够结合lgG单体的Fc?R，对单体IgG的亲和力极强，是低亲和力lgGFc受体(FcTRII、Fc?RIII)的10．100倍，免疫反应早期，抗体浓度较低，活化性Fc?RI也能捕获低浓度的免疫复合物，活化性FcTRI与低亲雨I力IgGFcTR相比在免疫效应细胞对抗原的提警、加：f：及摄入等方面发挥的作用的能力都高【17J。但激活型Fc^rRI对lgG的结合也有选择性，其中对小鼠的IgG2a和人的IgG3、lgGI都有较高亲和力，但是对人的lgG4、lgG2的具有较低的亲和力¨引。人FcTRI形成4种转录体其由3个同源基因编码，分别是：huFcTRlC、huFcyRIB和huFcTRlA。其中huFcRIa编码3个lg样结构域跨膜受体蛋白，冈为缺失跨膜区和胞内区的huFcRIbl和huFcRlc从而形成可溶性受体，huFcRlB的选择性剪接的产物huFcRIb2，因为在第三个lg样胞外域缺失，其跨膜受体蛋白只有2个Ig样结构域，试验中发现huFcRIb2只结合IgG复合物，不能有效的结合单体IgG【l91，由上述资料可以看出FcYRI受体的高亲和力可能和其胞外域第三个Ig结构域可能有一定的关系。家畜的研究中，最早是牛的IgOFc]'RI基因被首先克隆出来。Clarkson和Symons在1992年从牛的淋巴细胞DNA文库中获成功的获取到牛FcTRl胞外区基因片段，Yah等120J于2000年从牛的PAM细胞的cDNA文库中成功的克隆了牛的全长Fc?Rl基因。用生物学软件分析之后结果显示，在配体结合区域小鼠FcTRl、人FcTRI和牛FcTRI三者之间同源性很高。Zhang等【2112006年首次从猪肺泡巨噬细胞中克隆出FcyRl基因，并将其转染入COS．7细胞，检测猪Fc^rRI在COS．7细胞表面的表达情况，并对该受体的配体的生物学特性进行了研究。他们最近又克隆出绵羊的FcTRl，在进行的配体亲和研究中发现绵羊Fc?RI受体不能结合第5页共59页 河南农业大学2013届硕士研究生学位论文绵羊IgG2只能结合绵羊lgGIl22J。1．2．2FcTRII(CD32)Fcl'RII(CD32)是抑制型F叫R，是一种分子量为40kD左右的I型跨膜糖蛋白，主要表达于郎罕氏细胞、B细胞、血小板、DC细胞巨噬细胞、粒细胞、淋巴细胞和单核细胞等细胞，FcyRII在血管内皮细胞和胎盘基质细胞中也有表达【23】，是一种低亲和力的FcTR受体。FcTRII是一条链受体，胞外区含有2个lg样结构域，胞内区q链含有与信号传递有关的酪氨酸的受体活化基序(huFcTRIIa和huFcyRIIc)或酪氨酸的受体抑制基序(huFcyRIIb)基序123I，不刖Y链辅助能够独自行进行信号传递，抑制型FcTRII在机体内不结合单体lgG只能和复合物IgG或IgG多聚体结合【24l。人的FcyRII主要有位于lq23．24的3种Ⅱ型分别是：、FcTRIIC、FcTRIIB、FcyRIIA。各个亚型能够产生多个转录体，这是因为mRNA选择性剪接方式不同。人的huFcTRIIA有FcTRIIal、F吖RIIa2两个转录产物；人的huFcyRIIB由FcTRIIbl、FcTRIIb2、FcTRIIb3、F吖RIIb4和FcTRIIb5等至少5个转录体，他们这5个不同剪接产物的转录体其胞内区和信号肽有明显的差异，但是胞外区高度保守；huFcyRIIC和huFcyRIIA的胞内区完全相同，且胞外区和跨膜区同源性极高为95％；huFcTRIIbl和huFcTRIIb2胞内区完全不同，但跨膜区与胞外区和huFcyRIIA相比同源性为95％。小鼠只有抑制型受体FcTRIIB基因，没有FcTRIIA和FcTRIIC激活型受体，小鼠和人的主要有FcTRIIbi和FcTRIIb2两种异构体分子的FcTRIIB。FcyRIIbl比FcTRIIb2多了一个在近靠近细胞膜端胞浆编码蛋白的氨基酸外显子序列，人类的FcTRIIb2缺少19个氨基酸，小鼠的FcTRIIb2则缺少47个氨基酸。更深入的研究显示lgGFcTR介导的细胞对抗原抗体复合物的内吞功能和这段序列有一定的关系1”】。FcTRIIB是目前发现的FcTR中唯一的抑制型受体，在研究发现人和小鼠的FcTRIIB有一段高度保守的酪氨酸的受体抑制基序(1／VxYxxL)，这段序列存在胞浆区内c3外显子编码的氨基酸序列中。抑制型FcyRIIB和激活型性受体(FcTRI、BCR、Fc一、／RIII等)交联后，抑制的激活型性受体胞内区的酪氨酸受体活化基序传导活化信号1261。若抑制型受体FcyRIIB的信号转导作川被抑制，就会造成生物体免疫调：肖功能的紊乱，导致生物体处丁．过敏状态，从而造成自身免疫性疾病发生率高131。在家畜中的研究中，牛的FcyRII基冈最早得到克隆和鉴定，之后绵羊和猪的FcTRII也被克隆和鉴定。Zhang等【27】在1994年从牛的PAM细胞中克隆出牛Fc，、／RII全长基因序列。生物软件分析后显示boFcyRII、小鼠和人的抑制型FcTRIIB的氨基酸序列具有高度的同源性。之后将牛FcTRII全长基因序列转染COS一7细胞，在进行配体亲和特性鉴定试验中发现boFcTRII不能结合牛lgG2，与lgGl有较高亲和力。氨基酸分析中发现牛FcTRII胞内区内编码的成熟蛋白中一段序列：AENTVTYSLL，与小鼠和人的抑制型FcTRIIB胞内区的酪氨酸的受体抑制基序完全相同，这些显示该boFcTRII受体可能具有小鼠和人的抑制型FcTRIIB一样的免疫抑制功能【28】。乔松林等冽在2006年第一次从克隆出猪FcTRIIB基因并第6页共59页 河南农业大学2013届硕士研究生学位论文对此进行了鉴定，随后将克隆的FqRIIB基因转染COS．7细胞，分析其生物学功能，并研究了猪组织中Fc?RHBmRNA的表达分布情况。随后本实验室研究发现其胞内区有19个氨基酸插入的选择性剪接异构体，转染COS．-7细胞系，发现该异构体具备结合抗原抗体复合物的生物学功能。随后xia【：29】等克隆出猪Fc丫RIIB，经氨基酸分析后发现猪FcYRIIB胞内区插入19个氨基酸，并将其转染COS．7细胞，研究中发现该选择性剪接异构体能够与抗原抗体复合物结合。1．2．3Fc?RIII(CDl61Fc?RI(CDi6)是激活型FcTR，是一种分子量为50．80kDa的高度糖基化的膜糖蛋白，有2个lg样胞夕I-IX结构域，是唯一在白然杀性细胞中表达的Fc受体U61。它由两个不同的基冈编码，它们在不同细胞类型上选择性表达。在单核细胞、巨噬细胞、NK细胞表面上表达的是一种被称为Fc丫II[A的跨膜糖蛋白，另一个Fc丫III基因编码表达糖基磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidylinositol，GPI)连接的蛋白质，称为Fc丫IIIB，它只在嗜中性粒细胞上表达。主要是过FcR吖链，以及与其相连的免疫受体酪氨酸激活基序的相互作用触发细胞活化。FcTRIII奠／低亲和力受体，人的huFc?RIIIA0【链胞内区没有不含转导信号基序，它常常和T细胞受体薯链二聚体、FcR1，一TCR号链异源二聚体或FcR-丫链二聚体相交联，huFc^rRIIIAc【链通过这些Ⅱ基的酪氨酸受体活化基序激活免疫效应细胞，转导信号。Fc?RIIIB的胞内区和跨膜区缺少，不能和TcR毛链或者FcR1，链发生偶联，而是通过GPI锚定在细胞膜表面，人们推测Fc?RIIIB可能对F哪RII具有协同作用，从而够增强效应细胞反应p1。在家畜中的研究中，猪的FcTRIIIA是第一个被克隆与鉴定，研究显示其胞内区与FcR．Y链还有其他亚基相连i3¨。有研究显示，从伽T细胞中运用RT-PCR技术克隆出的牛FcYRHI受体蛋白不是糖基磷脂酰肌醇锚定受体而是跨膜蛋白，但与人的FcrRIIIA具有高度的同源【3射。单独把牛的FcTRIIIA转染Ncos．7细胞，发现牛的Fcl，RIIIA受体蛋白不能在COS一7细胞表面进行表达，原因可能是COS．-7细胞不能编码表达Y弧单位。Yah等133】在200年从的牛肺巨噬细胞克隆并鉴定Fcl，RIIIeDNA基因，生物学研究中发现克隆牛Fc?RIII编码胞外区蛋白只包含一个lg样结构域，克隆出Fc^rRIII受体可能是牛FcTRHIA的选择性剪接体的变异基冈。1．2．4moFcTRlVmoFc?RiV是激活型FcTR。Nimmerjahn等于2005年发现一种新的moFc?R，moFcTRiV只在单核细胞、DC细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞中表达，在NK细胞、B细胞、T细胞中都不表达。moFc?RlV的信号转导和表达依赖FcR1，链，只转染moFc?RIV基因，则不能检测到moFc?RlV受体蛋白在转染细胞表面表达，只有moFcTRlV年IlFcR．1，链共同转染细胞后，才能检测到moFc丫R1V的在转染的细胞中表达【34】。moFc丫RlV不结合小鼠IgGl和lgG3，只能可特异结合和lgG2aNllgG2b结合，是一种中等亲和力的IgGFc?R134|。1．2．5boFcY2RboFcT2R的胞外区还有两个Ig样结构域，ZhangG[351等于1995年利用功能性亲和分子克第7页共59页 河南农业大学2013届硕士研究生学位论文隆系统技术从牛的肺泡巨噬细胞中克隆出牛boFcy2R，把boFcy2R转染入COS一7细胞，研究结果显示boF吖2R不能结合牛lgGl而能特异性结合牛lgG2。牛IgG2Fc受体和已经知道的小鼠和人F唧R相比差异极大，不能与牛雨1人的IgA结合，而与人白细胞Ig样受体(1eukocytelg．1ikereceptor，LIR)、IgAFc受体(huFcctRl，CD89)$11人杀伤细胞抑制受体(humankillercellinhibitoryreceptor，KIR)同属于一个新的基因家族，可能代表一类新型哺乳动物的igGFc受体。boFcl,2R对牛lgG2具有中等亲和力，其胞外区包含有2个lg样结构域，胞内区显著短丁．其它FcyR，因此推到可能其信号转导对FcR吖链也有依赖性136、37]o用流式细胞检测技术结果看出，boFcy2R只表达与嗜中性粒细胞雨1单核细胞，而在DC细胞、B细胞、T细胞和嗜酸性粒细胞中没有检测到boFey2R的表达(3引。1．3FcyR的免疫学功能1．3．1调节抗体介导的细胞活化FcYR一个最重要的免疫学功能是对细胞生物学效应发挥正向和负向调：I了作用，激活型lgGFc受体与抑制型lgGFC受体共表达于免疫细胞表面，二者的相互作用对免疫细胞的活化进行免疫调：1妒一1。FcyRI和F吖RIII通过与FcR一^r链的受体酪氨酸激活基序偶联然后触发免疫细胞的活化，传递活化信号，抑制型受体FcyRIIB胞内区含有保守的特定序列受体酪氨酸抑制基序，通过免疫复合物与激活型受体(FcyRI、FcyRIIA、FcyRIII丰IIBCR)发生偶联，抑制受体酪氨酸激活基序诱导的细胞活化，造成B细胞发生凋亡现象【38】。有研究显示，抑制型受体FcyRIIB对B细胞在外重免疫耐受中非常重要【3川，基因敲FcyRIIB4"鼠更容易发生自身免疫性疾病139】。自身免疫B细胞可以在在B细胞成熟的不同阶段出现，在B细胞的成熟晚期，抑制型受体FcyRIIB介导发生自身免疫耐受【4⋯。1．3．2介导抗体亚类的不同免疫功能研究显示，不同动物IgG可以分为不同种类的IgGⅡ类，不同亚类的lgG在体内都发挥着不一样的免疫作心。小鼠的激活型受体FcyRIV直结合lgG2a、lgG2b对其有中等亲和能力，但与lgGl、lgG3不结合。小鼠lgG2a、IgG2b在集机体免疫中发挥活化作用，是抗感染免疫的主要IgG。有学者提出不同lgG弧类和激活型受体鱼抑制型受体亲和力不同，有研究证实，lgG亚类发挥不同免疫生物学效应的分子基础是和激活型受体与抑制型受体不同的亲和Eh(A／1)。lgG1类抗体与激活型受体FcyRIII结合，和抑制型受体FwRIIB结合，FwRIIB的A／I比为0．1，抑制型受体FcyRIIB严格调控IgGl；但lgG2aA／I比值是70，lgG2b的A／I比值是7，这两种lgG亚类可能更具有激活功能的lgG亚类【41】。1．3．3介导细胞吞噬作用激活型FwR平IIIgGFc片段的结合能触发一系列的细胞免疫反应其中包括ADCC、吞噬作J|丰|、抗原提呈和分泌促炎性介质等。巨噬细胞和嗜中性粒细胞都是专一的吞噬细胞，主要是通过FcyR介导完成吞噬作用，其细胞吞噬>0．51xm的颗粒。如果缺失FcyRI或者其他FcyR会造成巨噬细胞丧失吞噬作用142I。研究显示，颗粒性如病毒与细菌感染细胞-与IgG结合，这些第8页共59页 河南农业大学2013届硕士研究生学位论文复合物结合细胞表面的FcTR后，会引起FcyR聚集的发生，SRC酪氨酸激酶家族被激活，磷酸化受体酪氨酸激活基序，SYK激酶结合位点形成，募集细胞吞噬功能所必须得SYK激酶，进而激活下游的信号通路。细胞吞噬功能中的关键酶SYK激酶，若巨噬细胞缺失SYK激酶会引造成吞噬杯(phagocyticcup)不能关闭，细胞吞噬有关的信号包括：RHO家族GTP酶、C一+流通、磷酸酶D、P1．3K、PKC、PLC-y、和PLA2等，PI一3K在FcTR介导吞噬过程中起决定性作用【43|。还有资料显示，只有抑制型F哪RIIB表达的巨噬细胞同样有吞噬可溶性免疫复合物的能力，可以推测抑$1J型FcTRIIB对细胞吞噬作用有正向调=肖作用【44】。1．3．4介导ADCC作用巨噬细胞雨INK细胞通过Fc受体实现对抗体结合细胞的ADCC作J【_I]是肿瘤抗原特异性抗体杀灭肿瘤细胞的主要机制。有资料研究表明，在单核细胞介导的ADCC效应中，IgG矛lllgA一起出现时时比IgG单独出现时有更具有强烈的细胞毒效应【451。在研究小鼠黑素瘤转移模型中显示，TA77特异性单克隆抗体能有效的抑制肿瘤细胞的扩散和转移【461，但是，缺陷抑制型FcyRIIB则明显增强TA77特异性单克隆抗体在小鼠体内的细胞毒性【471。白然杀伤性细胞中表达激活型FcyRIII，不表达抑制型受体FcyRIIB，因此基因缺失抑制型Fc^rRIIn4'鼠中发挥的细胞毒性作用可能滴巨噬细胞的ADCC作刚。但是在疗FcyRIIB缺陷小鼠乳腺癌中肿瘤特异性抗体治治疗效果依然不明显1481。冈此，抑制型受体FcyRIIB对ADCC作用的起负向凋：肖作存在着争议，有待于进一步更加深入的研究。1．3．5介导树突状细胞抗原提呈抗原进入细胞主要是由细胞表面FcyR接介导的，之后抗原特异性T细胞发生强烈的细胞反应。激活型受体能够促进MHCl类分子和II类分子递早抗原和诱导DC细胞的发育成熟，高效的诱导免疫细胞对特异性抗原免疫应答【491。与游离状态的抗原相比，树突状细胞细胞更有效把免疫复合物与FcyR相作JI{jJ内化到细胞内，FcTR能够高效的介导抗原的内化从而能够有效的启动树突状细胞独特的抗原提成信号通路，当抗原分子在细胞中被细胞质内的蛋白酶降解成多肽后，然后将这些多肽转移至细胞内质网腔和MHCI类分子发生结合，然后递早至细胞表面1501。树突状细胞表面的Fcl，R和免疫复合物结合后能显著增强树突状细胞的抗原捉呈作用，但是还不清楚抑制型受体FcyRIIB在抗原提呈是否有作用。有资料显示抑制型受体(Fc?RIIB)和激活型受体(FcTRI、Fc?RIII等)一样都能诱导免疫复合物内化到树突状细胞内，这就表明抑制型受体和激活型受体都能促进MHCI类分子或者MHCII类分子限制的提呈抗原【5l】。但是还有资料显示缺失了抑制型受体FcyRIIB反而能够显著的增强卵清白蛋白特异性细胞毒T细胞生物学反应，这就显示抑制型受体FcyRIIB对F吖R介导的抗原提旱作用的途径中起负调控【52】。FcyRIIB抑制型受体在DC抗原提早作JHj中所发挥的作J}fj仍然不清楚，需要进一步验证。第9页共59页 河南农业人学2013届．rOitODZ生学位论文文献综述二PRRSV研究进展猪繁殖与呼吸障碍综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)俗称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRsv)一种急性病毒性传染病。该病主要特征障甜、呼吸道疾病、哺乳仔猪的高死亡率、免疫抑制和持续性感染等特征，主要引起妊娠母猪晚期的流产、甲．产、产木乃伊胎、夕匕胎和弱胎盼531。该病最早发生丁，1987年美国的北}罗林那州、明尼苏达州和依荷华州【54】，住我国，台湾养猪科学研究所1993年首次报道PRRS在该地区流行f551。最初在人陆爆发PRRS是在1995年间由北京、上海开始的，随后向其周同的地区和省份蔓延。郭宝清等人1996年首次从国内疑似该病的猪群中分离出PRRSV，从而证实我国存在本病【56I。2006年，全国22个省份的猪群中出现了猪持续高热为特征的猪病，称之为“猪无名高热病”，随后中国农业部兽医局做了人量的研究，止式将“猪无名高热病”的病冈定为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP．PRRSV)。由丁．本病很难在猪群中得到进化，给中国的养猪业带米了巨人的损火，需要人们更加深入的研究该病的发病机制。1、PRRSV的生物学特性PRRSV是一种直径为50．65nm，有囊膜的不分仃段的单股止链RNA病毒，主要分为可分为欧洲型(LV株为代表株)和美洲型(VR2332株为代表株)，我过多是美洲型，少量欧洲璎。PRRSV的基冈组全K人约为15kb，有9个相互重替的开放阅读框(ORF)组成，ORFI位丁基因组的3’端，包括ORFla和ORFlb，I‘l‘整个基冈的80％，主要编码编码病毒的复制酶和RNA聚合酶活性蛋白。ORF2．ORF7在基冈组的5端，ORF2．ORF4主要编码囊膜有关的糖蛋白即次要结构蛋白GP2．GP4。ORF5编码病毒的囊膜蛋白(GP5)，ORF6编码病毒的膜蛋白(M)，ORF7主要编码核农壳蛋白(N)，其中GP5利M是病毒主要表位抗原，研究的比较多158-621。5’CaPRRSVGenome第10页共59页(A)n 河南农业大学2013届硕士研究生学位论文2、PRRSV对细胞的亲嗜性PRRSV在猪体内主要亲嗜性是单核细胞和肺泡巨噬细胞(PAM)，其中PAM是PRRSV感染猪体内后最先攻击的靶细胞。PRRSV在体外也能感染经灌流收集的肺泡巨噬细胞(PAM)上生长，也能在非洲绿猴。肾细胞MA一104、Marc．145、CL一2621、猪睾丸生殖细胞等细胞，在这些细胞上均能产生细胞病变【631。3、PRRSV的免疫学特性3．1PRRSV的抗体依赖增强作用抗体依赖增强(Antibody．dependentenhancement，ADE)最早是1964年Hawkesl641在研究中媒病毒中发现的，Yoon【65661等人最y-研究发现PRRSV也存在ADE效应，2004年Cancel．Tirado[671等通过单克隆抗体研究发现PRRSVADE效应相关的表位定位为GP5和N蛋白上，只有产生足够量的中和抗体才能有效的抑制PRRSV侵害机体。今年来人们对PRRSVADE机制研究逐步深入，发现猪的IgGFcTRIl6引、FcyRIIB1691、FcTRIIIt701均能介导PRRSV的抗体依赖增强作用，这些研究都显示在PAM细胞中加入适当PRRSV抗体，可以是提高PRRSV在PAM细胞中的复制，只有抗体水平达到一定量的时候才能抑制PRRSV的增殖，否则有助于PRRSV的复制。3．2PRRSV的体液免疫和细胞免疫病原体感染机体后，体液免疫和细胞免疫发挥着非常重要的作用，是机体抵御病原微生物侵害机体的重要手段。但是PRRSV感染机体后体液免疫和细胞免疫都很特别。有研究显示，PRRSV感染猪体后，在21—49天，PRRSV特异性抗体达到最大量，但是产生的火量IgM、lgG并不能保护机体免受PRRSV侵害，其没有中和作用。1994年，NelsonEA等用美洲株PRRSV研究其体液免疫特点，结果显示，PRRSVN蛋白抗体是最早检测到，其次是PRRSVM蛋白抗体，接着是PRRSVGP5蛋白抗体【7’1。PRRSVN蛋白抗体在感染后一周就能检测到，能够持续儿个月，但是此抗体并没有保护作tI{；j。PRRSV最重要的中j；}11抗体是GP5蛋白抗体‘721，但是此抗体产生的比较晚，PRRSV干扰30天左右才能检测到GP5蛋白抗体的产生，感染后lO周才能达到最高峰，尽管GP5蛋白抗体持续时间很长，但是其水平很低，对猪体其不到保护作用173l。这样给PRRSV疫苗研制造成了严峻的挑战。细胞免疫对于PRRSV非常重要。猪体感染PRRSV后机体内有明显的淋巴细胞增殖反应，但是出现的很晚知道PRRSV感染后28天才能检测到，感染后49天增殖反应达到高峰，感染后77天开始减少【741，和中和抗体产生的过程极其相似。PRRSV感染后，能够抑制细胞网子1FN．仪的分泌【751，能够显著的提高lL．10mRNA的转录【76】。3．3PRRSV免疫抑制PRRSV具有严格的细胞嗜性，主要感染猪猪肺泡巨噬细胞和单核细胞，造成其数量减少，诱导细胞发生凋亡，从而造成机体的免疫功能下降。此时病毒可能逃宿主细胞的抗病毒反应使机体的免疫力下降。因此，病毒很可能从免疫系统中逃脱，不能被机体免疫系统识别第11页共59页 河南农业大学2013届硕：上研究生学位论文和清除n引，PAM细胞或单核细胞感染PRRSV使其表面抗原调节和表达能力减弱甚至丧失，能够导致机体长时间的持续性感染和病毒血症【78培11。还有研究资料表明：临床实践中，机体感染PRRSV后，免疫力F降，此时一些细菌和呼吸道病毒能够很轻易突破机体的免疫屏障，引起继发感染，增加呼吸道疾病的发生概率。还能够减少单核巨噬细胞和淋巴细胞的数量，以上都显示了PRRSV的免疫抑制作刚【81’821。Galina、ReethV等做了人量研究发现，猪体感染了PRRSV后能够促进猪链球菌、呼吸道冠状病毒汞l猪流感病毒的感染。体外研究表明，PRRSV显著增加PCV-2感染猪体，促进PCV-2的增殖。经常能够从感染PRRSV的机体中分离山猪胸膜肺炎放线杆菌、化脓性放线菌、猪肺炎支原体、副猪嗜血．杆菌等多种病原体『83塔6I。在急性感染PRRSV甲．期，全身性免疫反应被推迟，机体对侵入的其他病原微生物的免疫反应也减弱【87_881，同时也能抑制伪狂犬疫苗和猪瘟疫苗发挥作用。有资料证明，IFN一伐的表达被抑制在感染PRRSV后【891，IFN．0【的表达被阻断Thl细胞的免疫反应会受到影响当IFN—n的表达被阻断。3．4PRRSV的持续性感染PRRSV的持续性感染是人家公认的，持续性感染的带毒猪在没有明显的临床症状，但是能够将携带的PRRSV传染给其他健康猪群或者是经过垂直将病毒传播给胎儿，PRRSV能在猪体内长期存在，猪场一旦感染PRRSV，很难清除。人．I：感染PRRSV后，猪体在14．21天内山现病毒血症，不同的年龄段和PRRSV数量不同，其病毒血症存在的时间不一样，有资料显示，PRRSV感染42—49天后，能够从组织、肺脏、淋巴组织、血液能组织中以让能够分离山PRRSV。Mengeling等研究发现，PRRSV感染猪体后，1h之后就能从肺泡巨噬细胞中检测到PRRSV的存在，在感染63天后依然能够从肺泡巨噬细胞中检测到PRRSV抗原。Dua3n等刚PRRSV感染42日龄的小猪，感染后3大，在肺、肺泡巨噬细胞、淋巴结等多个组织检测到PRRSV，7周后依然能够在肺泡巨噬细胞发现PRRSV的存在，3～28d有病毒血症状。Mengling等在PRRSV感染28天后最后一次从血清中检测到病毒的存在，63天后依然能够从肺泡巨噬细胞检测到PRRSV存在，这些资料显示循环抗体在肺部的影响比在血清小。持续性感染病猪在一些应激因素的影响卜．能够向外扩散PRRSV。新出生的乳猪的被动免疫期非常有限，母源抗体水平在仔猪出生28天后开始下降，56天后达到最低水平，此时最易感染PRRSV。还有资料显示。母猪在感染PRRSV不久后主动免疫力慢慢丧失，72天后下降最低，此时非常危险。引起PRRSV持续性感染的重要原因之一是猪体内的病毒血症，他能够向外扩散PRRSV，怀孕母猪很有旨能产卜I携带PRRSV的仔猪，造成循环传播。PRRSV的持续性感染的原因可能是弱毒苗也能够传播PRRSV，Botner等用美洲株弱毒PRRSV疫苗免疫接种健康猪群，270天后，从免疫猪群和对照的猪群中都检测到美洲株弱毒。美洲株弱毒不进使猪群发生PRRS，而且从在流产的胎儿中也发现了该毒株凹、9¨。第12页共59页 河南农业大学2013届硕士研究生学位论文4PRRSV的诊断在实际中PRRS的病理剖检和临床症状没有典型的特征性标志，很难用肉眼来诊断该病，这样的情况给该病的诊断带来了很大的麻烦，但是可以进行实验室综合诊断192。31。4．1血清学检测4．1．1酶联免疫吸附试验(ELISA)酶联免疫吸附试验是免疫学的一个基本技术，简称为ELISA，七十年代初开始出现，发展速度惊人，Engvall和Perlmann等，在1971年用ELISA方法来测定lgG的量，他们的创新点在—『．检测液体标本中的微量物质，随后生物学和医学等许多学科都运川这种技术1941。AlbinaE等首次川PRRSV感染猪肺巨噬细胞，将收集纯化的PRRSV制备成抗原，检测血清中的PRRSV抗体，这种方法被川米应川在PRRS间接酶联免疫吸附试验：TakikawaN等研究研究发现PRRSV可以在Marc．145细胞中增殖，这使人们更容易获得PRRSVl95】；蔡雪晖等利用转瓶技术人大提高了PRRSV的产量，还应用三氯三氟乙烷处理PRRSV，PRRSV的N蛋白被充分的暴露，抗原检测敏感性人幅提高。以上ELISA运用全病来检测抗原，这种方法存在很多弊端，人们开始研究新的技术手段来检测PRRSV[961。有资料显示，N蛋白在PRRSV病毒粒子中的含量是最高，且PRRSV的N蛋白具有良好的免疫原性，人们心中比较理想的PRRSV诊断抗原就是重组的PRRSVN蛋白。吴延功、千云峰等运用重组杆状病毒和昆虫杆状病毒表达系统表达的重组PRRSVN蛋白，并将其作为PRRSV抗原，建立了重组PRRSVN蛋白的ELISA检测方法，并检测感染PRRSV的病猪，有非常好的检测效果例。4．1．2乳胶凝集试验(LAT)千忠等通过诱导表达重组的PRRSVM蛋白，并川致敏乳胶颗粒将重组的N蛋白制备成抗原，可以检测感染PRRSV病猪血清中的抗体【981。4．1．3免疫胶体金技术方莹等将胶体金层析技术相平IIELISA原理相结合，成功的研制了检il),lgPRRSV免疫快速诊断试纸【991。4．2分子生物学检测4．2．1反转录．聚合酶链反应(RT-PCR)SuarezP等根据NCBI中公布的ORF7序列，设计了一对特异性引物，利JHjRT-PCR技术对多个PRRSV毒株中进行检测，扩增出预期人小的特异性的片段，并进行克隆测序、同源分析，有相当高的同源率‘991。4．2．2套式PCRChristopher—Hennings等根据PRRSv的ORFlb和ORF7两个开放阅读框设计特异性引物检测PRRSV，这种方法比普通PCR的灵敏度提高100倍左右【100。1011。4．2．3核酸探针原位杂交技术(ISH)第13页共59页 河南农业人学2013届硕二匕研究生学位论文Mardassi等把用特异性引物扩增出PRRSV特异性的片段制备成高辛探针，检测猪体内是否存在PRRSV。Sur等用这种方法来检测PRRSVmRNA在猪体内各个组织中的含型1021。4．2．3实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR最早是由KHoeiler等研发的，本实验室段二珍等根据NCBI公布的ORF7序列设计一对特异性引物建立一种PRRSV的SYBRGreenI实时荧光定量PCR检测方法。第14页共59页 河南农业大学2013届硕士研究生学位论文引言lgGFc受体(Fcreceptor，FcR)是一类重要的免疫细胞表面分子，能够特异亲和免疫球蛋白(Ig)的Fc区域，是非常重要的免疫细胞表面分子，在机体免疫防御中有很重要的作用，是细胞免疫和体液免疫的桥梁。它是免疫应答中重要的膜性调：霄分子，表达于大部分白细胞的表面，其中位于免疫细胞表面的Fc受体可以通过与抗原抗体复合物结合诱导广‘泛的免疫学反应。根据Fcl,R胞内|又：特有的基序可以将FcTR分为激活型受体和抑制型受体两人类，他们一起表达在巨噬细胞、单核细胞等细胞表面，共同调节抗体对免疫细胞的活化作用，激活裂受体能激活免疫效应细胞，诱导吞噬作用、抗体依赖细胞毒作川、补体依赖细胞毒作JH；j，细胞裂解、分泌细胞因子和其它炎性因子、以及调一仃淋巴细胞增殖利分化等多种免疫学效应。PRRSV的一个重要免疫学特征是具有ADE作用，PRRSV的ADE作用免疫学特点给其免疫防控带来了一定困难，有许多学者研究显示Fc受体能够介导PRRSV的ADE效应，但是目前Fc受体具体分子机制还不清楚。本试验川纯化鼠抗猪FcTRI胞外区lgG、Fc?RIIB胞外区lgG、Fcl'RIII胞外区lgG、PRRS特异性IgG、非特异性lgG、鼠阴性IgG等不同的方法处理PAM细胞，通过荧光定量PCR技术研究猪激活型Fc],R(FcTRI和FeTRIII)在PRRSV感染中的作用，为PRRSV的感染宿主细胞的机理奠定基础。第15页共59页 河南农业火学2013届硕：￡研究生学位论文试验一抗体在PRRSV感染PAM中的作用猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)所引起猪的一种高度接触性病毒传染病，以母猪繁殖障碍和新生仔猪呼吸道障碍为主要特征的传染病，我国于1995年发现该病，该病对我国养猪业发展的带米了非常深的影响。人们对其的研究投入了人量的人力及物力，研究结果对其的致病机带,Ull免疫机理的作川方式仍然不清楚。PRRSV该病毒属丁‘动脉炎病毒科、动脉炎病毒属，单股止链RNA病毒，在体内主要感染感染单核细胞汞I巨噬细胞，造成免疫抑制；在体外主要感染PAM细胞矛lltt洲绿猴肾细胞系如Marc一145细胞，具有很强的细胞嗜性。多数病毒感染宿主细胞，第一步是病毒吸附于细胞表面，主要通过病毒表面蛋白和靶细胞膜上的复合受体蛋白或特异性受体的相互结合介导的。然而病毒某些蛋白的特异性抗体通常能够抑制病毒和靶细胞结合，使病毒丧失感染宿主细胞的能力，这种现象称为抗体的“中和作刚”。但是在一些情况卜．，某些病毒的特异性抗体却能够促进病毒进入靶细胞，这种现象主要通过细胞表面的Fc受体介导的，这种作刚方式称之为病毒感染的抗体依赖性增强作川(Antibody-dependentenhancement，ADE)。人量研究资料表明PRRSV感染PAM细胞是通过复合受体调1，或特异性受体进入的，研究还发现在PRRSV感染宿主细胞的过程中，Ⅱ中和剂量的特异性抗体能够增强PRRSV的感染力。但在猪体内同时也存在一些PRRS非特异性抗体和免疫复合物，而关丁．这些非特异性抗体和免疫复合物能否增强PRRSV的感染力的研究很少。本试验主要通过研究不同特性的抗体对PRRSV增殖的影响，来进一步探讨PRRSV感染的抗体依赖性增强机制。1材料1．1毒株与实验动物PRRSVHn-I／06株(GenBankID：FJ2374】8)(TCID50为1046／0．1mL)为本实验室分离并保存，由本人在Marc．145细胞上进行增殖培养；PRRSV抗原、抗体均为阴性的20日龄健康火白仔猪，购自郑州某猪场。1．2抗体PRRSV阴性(PRRSV抗体及病原检测均阴性)健康猪IgG和兔抗猪IgG，PRRSV特异性抗体lgG，纯化鼠抗猪FcTRIIB胞外区IgG，均由河南农业大学兽医微生物研究室保存。1．3主要试剂及配制1．2．1pH7．450mmol／L的PBS缓冲液在电子天平上称取Na2HP04．12H20i．4489，NaCI4．09，KH2P04O．1g，KCl0．1g，溶于400ml双蒸水中，调节pH值至7．2—7．4，加双蒸水定容至500ml，121℃灭菌高压后，4℃保存备用。第16页共59页 河南农业大学2013届硕士研究生学位论文1．2。2细胞培养营养RPMI一1640在无菌操作台中取1袋RPMI一1640干粉溶于成有高压后无菌的含有800ml双蒸水的烧杯中充分搅拌至完全溶解，然后加双蒸水定容至1000ml，过滤除菌用0．22p．m滤膜，分装至500mi灭菌盐水瓶中，放置4"C冰箱中保存备用。1．2．310％新生牛血清细胞生长液1640在RPMI一1640细胞培养营养液中加入10％(按照体积Ll'3jtl入)新生牛血清，链霉素浓度为100IU／mL，青霉素浓度为1001U／mL，4℃保存各用。1．3其它试剂ReverseTranscriptaseM—MLV，dNTPs，RibonucleaseInhibitor、Trizol，SYBRPremixExTaq等购白TaKaRa公司；RPIM1640培养基干粉购白GIBCO公司；鼠阴性lgG、新生牛血清购自郑州益康生物工程有限公司：脂多糖购买于Sigma：青、链霉素购自华北制药股份有限公司。本试验用所到的材料的配制方法均参照《分子克隆实验指南第三版》Ii031和《动物病毒学》1i041。1．4主要仪器S2．93自动双重纯水蒸馏器上海弧荣移液器德国EppendorfSP—D垂直净化ij作台蚌埠净化设备厂制冰机(S1M—F124)SANYO冷冻离心机(3K30型)Sigma公司二氧化碳培养箱ThermoForma公司荧光定量PCR仪(ABl7500型)美国ABI公司24孔细胞培养板美国康宁公司2方法2．1PAM细胞的制备按照徐红运等【1051的方法获取PAM细胞。采用健康仔猪20日龄，肺脏无菌摘取，_刚含2000单位青链霉素的PBS液灌洗肺脏，每次倒入约150mLPBS，直至倒出的PBS液清亮。将灌洗液分装高压灭菌的离心管中，2000rmp／min离心20rain，用PBS液重悬洗涤两次PAM细胞。重：悬丁．10％新生牛血清的RPMI1640中。调整细胞浓度至5×106个／mi，24孔细胞培养板中加入O．5ml／；fL，置于37。C细胞培养箱中培养约6h，弃去未贴壁的细胞，用PBS漂洗一次，加入含有新鲜10％血清RPMll640营养液，置于37℃培养。2．2感染性免疫复合物的制备将纯化的2．64mg／ml猪PRRSV特异性IgO做2—16倍的倍比稀释后，与200TCIDsdl001al的PRRSVHn．i／06等体积混合均匀，在37。C感作lh制成不同浓度的感染性免疫复合物，第17页共59页 河南农业大学2013届硕士研究生学位论文标记为PRRSV-IgG。2．3免疫复合物的制备免疫复合物的制备：将纯化的的PRRSV阴性健康猪IgG(2．63mg／m1)和纯化兔抗猪lgG(2．64mg／m1)，经琼扩实验验证，琼扩效价为1：32。然后用双层滤膜(直径：0．22肚m)过滤除菌，PRRSV阴性健康猪IgG和兔抗猪lgG按照1：1的比例充分均匀混合，在37。C作J}lj1h制成不同浓度的免疫复合物，标记为lC。2．4不同浓度感染性免疫复合物对PRRSV增殖的影响试验将上述方法2．2中倍比稀释的感染性免疫复合物接种到PAM细胞上，24孑L细胞培养板，2009L／孑L。并设置接毒细胞对照，接毒细胞加入200个TCID50的PRRSVHn．I／06株病毒液200gL。每个稀释度做3孔平行对照。37。C吸附lh后弃上清，用无菌的PBS液漂洗一遍，加含10％血清的RPMI1640培养液，O．5mL／孑L，5％C02、37℃细胞培养箱中培养。24h后取出24孔细胞培养板，经过反复冻融三次后，用细胞刮刀刮下P：AM细胞，在无菌条件下连同细胞培养液一起转入灭菌的1．5mLEP管中。然后用段二珍等‘m6】建立的PRRSV实时定量(绝对荧光)PCR检测方法检测PAM细胞中PRRSV拷贝数。2．5不同浓度非感染性免疫复合物和猪阴性IgG对PRRSV增殖的影响试验将方法2．3制备的免疫复合物和猪阴性igG做2～16倍比稀释，分别与等体积的200个TClD50的PRRSVHn一I／06株病毒液混合，制备成非感染性免疫复合物PRRSV+IC和病毒与猪阴性IgG的混合液PRRSV+lgG，37。C吸附1h。将上述复合物接种剑PAM细胞上，24孔细胞培养板，2009L／孑L。并设置接毒细胞对照，接毒细胞加入200个TCID50的PRRSVHn．I／06株病毒液200gL。每个稀释度做3孔平行对照。376C吸附1h后弃上清，用无菌的PBS液漂洗一遍，加含10％血．清的RPMI1640培养液，0．5mL／孑L，5％C02、37℃细胞培养箱中培养。24h后收集样品，方法同2．4。2．6感染性免疫复合物处理PAM细胞对PRRSV在不同时间段的增殖影晌将浓度为1．30mg／mL的感染性免疫复合物处理PAM细胞，并设置接毒细胞对照，接毒细胞加入200个TCID50的PRRSVHn．I／06株病毒液200gL，3-37。C吸附1h后，弃去未吸附的复合物和病毒液，加含10％血清的RPMI1640培养液，0．5mL／孑L，5％C02、37℃细胞培养箱中分别培养12h、24h、36h、48h后收集样品方法同2．4。2．7非感染性免疫复合物和猪阴性IgG处理PAM对PRRSV在不同时间段的增殖影响将总浓度为1．30mg／mL免疫复合物和浓度为1．30mg／mLPRRSV阴性健康猪lgG，分别与等体积的200个TCID50的PRRSVHn一I／06株病毒液混合，制备成非感染性免疫复合物第18页共59页 河南农业大学2013届硕二}研究生学位论文PRRSV+IC和病毒与猪阴性196的混合液PRRSV+IgG，37。C吸附lh。处理PAM细胞，丁．370C吸附lh后，弃去未吸附的复合物，并加入无菌的PBS液0．5mL／孔，洗板一次。加含10％血清的RPMI1640培养液，0．5mL／孑l,，5％C02、37℃细胞分别培养箱中培养12h、24h、36h、48h后收集样品方法同2．4。2．8免疫复合物对FcTRIIB封闭的PAM细胞中PRRsV增殖的影响将纯化FcyRIIBlgG(550ug／m1)处理PAM细胞，200“L／孔，在5％C02、37℃细胞培养箱中封闭1h，将2．6和2．7中制各的感染性免疫复合物和非感性免疫复合物处理P：AM细胞，同时设立封闭细胞接毒组。37℃细胞培养箱中培养作J{；Jlh，弃去病毒混合液，用含有双抗无菌的PBS液轻柔漂洗一遍，然后加含没空加入0．5mL含有io％Jl台牛血清的RPM!1640培养液，0．5mL／孑L，5％C02、37℃细胞培养箱中培养。待病毒感染12h、24h、36h、48h后收集样品方法同2．4。2．9数据处理方法PRRSV拷贝数通过建立的标准曲线进行进行绝对定量检测。数据运用GraphPadPrism5软件进行处理。3结果3．1特异性抗体对PRRSV在PAM中增殖的影响用PRRSVSYBRGreenI实时定量PCR方法分别检测不同处理PAM细胞PRRSV的RNA水平。如图1一q显示，当感染性免疫复合物作2倍稀释时，PRRSV在健康PAM细胞中增殖最明显，即浓度为1．32mg／mL时，PRRSV增殖较纯病毒感染PAM细胞中病毒含量高约25．79倍，说明特异性抗体能够显著增强PRRSV的增殖。如图1．2，感染性免疫复合物在PRRSV感染PAM细胞的不同时间(12h、24h、36h和48h)内，能促进PRRSV的增殖，在感染48h内PAM细胞中的病毒含量较无感染性免疫复合物组高约19．47—99．47倍，在感染36h时PAM细胞中的病毒含量较无感染性免疫复合物组PRRSV增殖差异最人达到99．47倍，说明浓度为1．32mg／mL感染性免疫复合物在48h内能够增强PRRSV的增殖，在36h时作用最强。(注：纵坐标所脂数据为PRRSV拷贝数的对数值)第19页共59页 河南农业大学2013届硕：b研究生学位论文V2x4x8x16x图1．1不同稀释度的感染性复合物处理后PRRSV的拷贝数Fig1-IThecopiesofPRRSVwithinaction·immuneduringdifferentdilutions圜PRRSV囡PRRSV+IC器10盘ou8《鼋6象4岛筮2∞30V2x4x8x16x图1．3不同稀释度免疫复合物处理后PRRSV的拷贝数Fig．1．3ThecopiesofPRRSVinhealthPAMcellstreatedwithnon-infectiouscomplexduringdifferentdilutions口PRRSV圆PRRSV-IgG12h24h36h48hTimepointsafterinfection图1．2不同时间段的感染性复合物处理后PRRSV的拷贝数Fig2ThecopiesofPRRSVwithinaction-immunecomplexindifferenttimes圜PRRSV圈PRRSV+IC12h24h36h48hTimepointsafterinfection图I-4不同时间段的非感染性免疫复合物处理后PRRS的拷贝数FigI-4ThecopiesofPRRSVwithnon-infectiousimmuncomplexesindifferenttimes3．2非感染性免疫复合物对PRRSV在PAM中增殖的影响如图1．3显示，免疫复合物作4倍稀释时，PRRSV在健康PAM细胞中增殖明显。即PRRSV阴性健康猪IgG乘J兔抗猪lgG浓度分别为0．65mg／mL时，PRRSV增殖较纯病毒感染PAM细胞中病毒含量高3．77倍，说明适量的浓度的免疫复合物能够增强PRRSV的增殖，在16倍第20页共59页86420砸Qldou《Z笔嗣>∞昌盛厶∞0186420砚oIdou《Z昌昌>∞名筐厶咖。一曲oIdou《Z笛昌>们为一厶卧01 河南农业大学2013届硕士研究生学位论文稀释时病毒含量略微低于纯病毒组，可能和免疫复合物本身性质有关。如图1．4所示，免疫复合物总浓度为1．30mg／mL的在PRRSV感染PAM细胞在48hlAJ，也能促进PRRSV的增殖，在感染48hI为PAM细胞中的病毒含量较无免疫复合物组高约3．66．5．03倍，在感染36h时PAM细胞中的病毒含量较无免疫复合物坌NPRRSV增殖差异最火达到6．55倍，说明总浓度为1．3mg／mL免疫复合物在48h匹J能够增强PRRSV的增殖，在36h时作用最强。3．3猪阴性IgG在PAM中增殖的影响如图1—5显示，仅PRRSV[绸’I生lgG作2倍稀释时，PRRSV在健康PAM细胞中增殖最明显，。即浓度为1．315mg／mL时，PRRSV增殖较纯病毒感染PAM细胞中病毒含莓高9．25倍，说明只有高浓度的猪阴。I生lgG才能够增强PRRSV的增殖，而其他浓度的病毒含量低丁．纯病毒组，可能和IgG和病毒本身的特性有关。如图1-6所示，将浓度为1．30mg／mLPRRSV[绸性健康猪IgG在PRRSV感染PAM细胞的48hILJ，能够促进PRRSV的增殖，在感染48h眺]PAM细胞中的病毒含量较无阴。I生IgG组高约6．21倍，在感染48时PAM细胞中的病毒含量较无无阴性IgG组PRRSV增殖著异最人达到6．21—28．79倍，说明浓度为1．30mg／mLPRRSV阴性lgG在48h内能够增强PRRSV的增殖，在48h时作刚最强。圈PRRSV圈PRRSV+IgGV2x4x8x16x图1．5不同稀释度的阴性lgG处理后PRRSV的拷贝数Fig．I-5ThecopiesofPRRSVinhealthPAMcellstreatedwithnegativeIgGduringdifferentdilutions圜PRRSV圈PRRSV+IgG12h24h36h48hTimepointsafterinfection图1．6不同时间段的阴性lgG处理后PRRSV的拷贝数Fig1-6ThecopiesofPRRSVwithnegativeigGindifferenttimes3．4免疫复合物对FcTRIIB封闭的PAM细胞中PRRSV增殖的影响FcTRllB封闭PAM细胞后用非感染性免疫复合物和感染性免疫复合物处理细胞后用建立的方法检测PRRSV的拷贝数。图1．7所示，在含有非感染性免疫复合物的处理组比不含非感染性免疫复合物的处理组相比，12h一48hPRRSV的拷贝数显著提高，提高5．99倍-16．02第21页共59页的oIdou《乙笛昌>∽与一厶Mo一∞QIdouq乙∥H昌>∞盛臣山M01 河南农业大学2013届硕二I：研究生学位论文倍，其中在48h复制能力最强；图1—8中可以看出感染性免疫复合物也显著增强PRRSV在PAM细胞中的复制，提高41．29倍．127．15倍，其中在36h复制能力最强，且感染性免疫复合物增强病毒复制的能力更强。推测免疫复合物可能是通过激活型受体途径增强PRRSV在PAM细胞中的复制。田Anti-Fc丫RIIBIgG+PRRSV圈Anti—Fq『RIlBIgG+PRRSV+IC12h24h36h48hTimepointsafterinfection图卜7FHRIIB封闭后非感染性免疫复合物处理的PAM细胞中PRRSV的拷贝数Fig1．7ThecopiesofPRRSVinthePAMcellsofwhichtheFcYRIIBwasblockedtreatedwithnon—infectiousimmunecomplexes固Anti-FcTRIIBIgG+PRRSV囝Anti-Fc?RIIBIgG+PRRSV-IgG12h24h36h48hTimepointsafterinfection图I-8FcTRIIB封闭后感染性免疫复合物处理的PAM细胞中PRRSV的拷贝数Figl-8ThecopiesofPRRSVinthePAMcellsofwhichtheF吖RIIBwasblockedtreatedwithinfectiousimmunecomplexes3．讨论PRRS是目前对我国养猪业危害最火的疾病之一，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸障碍为主要特征的传染病。其病原PRRSV容易发生变异，而且具有抗体依赖性增强作用(ADE)、在猪体内存在持续性感染并能对猪体产生免疫抑制，。其中PRRSV的ADE作刚是目前最难解决的问题，而且有关PRRSV-ADE的分子机制研究较少。PRRSV的一个显著生物学特性就是对巨噬细胞的亲嗜性。而PAM细胞可通过其表面表达的一系列受体分子发挥生物学功能，比如协调作川，调21了白身的分化、增殖、迁移、黏附、细胞毒作用、吞噬和凋亡【1071，通过这些作川来启动、放火和终JI-．免疫应答。在各种常见的ADE作用机制中【108】，主要有五种，即病毒与补体激活、病毒的特异性抗体形成的复合物分别于细胞上的cR交联和细胞表面的FcTR相互作用提高病毒对靶细胞的感染能力；抗体直接作用于病毒蛋白，激活其活性，这种方式也能增强病毒对靶细胞的感染力；抗体作用于病毒使病毒的蛋白构象发生变化，增强病毒和靶细胞表面受体结合能力；补体Clq和CIqR的的结合，引起病毒的抗体依赖增强作用；经抗体依赖增强作用促进病毒进入宿主第22页共59页∞Qldou《Z笛昌>价配昌山叫。厂I 河南农业大学2013届硕士研究生学位论文细胞，进入细胞的病毒能够抑制细胞表达抗病毒细胞因子。以上研究主要是病毒特异性抗体引起的病毒的ADE作用，而没有人研究非特异性抗体和免疫复合物引起病毒的ADE作用。本试验中，在感染性免疫复合物PRRSV-IgG)的存在下(如图1．1)，病毒感染24h后，PRRSV的水平始终高于纯病毒对照组，而且当复合物浓度为1．32mg／mL时，PRRSV的增殖水平最高，可达25．79倍，说明适当浓度的特异性抗体能够增强PRRSV在PAM细胞中的增殖；如图1—2，感染性免疫复合物浓度为1．30mg／mL在PRRSV感染PAM细胞在不同时间(12h、24h、36h和48h)内均能够增强PRRSV的感染，其中在36h时比纯病毒组增殖最明显，高99．47倍。如图1．3，免疫复合物的总浓度为1．30mg／mL时，PRRSV的RNA水平最高，高丁．纯病毒对照组3．77倍，而在免疫复合物的浓度0．165mg／mLPRRSV的RNA水平略低丁．纯病毒组；如图1．4所示，总浓度为1．30m∥mL的免疫复合物在48h内都高丁．纯病毒组，在36h比纯病毒组增殖最高，高2．28倍。如图1．5，PRRSV阴性lgG浓度为1．315m∥mL时，PRRSV增殖最明显，较纯病毒感染PAM细胞中病毒含量高9．25倍，其他浓度低丁．病毒组，说明只有高浓度的PRRSV阴性lgG才能增强PRRSV的增殖；图1-6所示，将浓度为1．30m∥mLPRRSV阴性健康猪lgG在48h内也能增强PRRSV的感染，其中在48h时比纯病毒增殖的最高，高28．79倍。图1．7和l一8中显示经FcTRIIB封闭的PAM细胞，含有非感染性免疫复合物的处理组和不含非感染性免疫复合物的处理组相比PRRSV的拷贝数显著提高，感染性免疫复合物也显著增强PRRSV在PAM细胞中的复制，且感染性免疫复合物增强病毒复制的能力更强。推测免疫复合物可通过激活型FcyR促进PRRSV的增殖。本试验通过研究不同特性的抗体对PRRSV的增殖的影响，确定了PRRSV在适当浓度抗体存在卜能够促进PRRSV的增殖。抗体影uI甸PRRSV的增殖主要是通过lgGFc受体(FcyR)来调‘肖的。lgGFc受体(FcTR)是lg基冈的超家族成员之一，是一类重要的免疫细胞表面分子。其中，活化型FcYR能诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性效应，并能参与抗原提早和凋理免疫细胞吞噬等。人和哺乳动物的IgGFc受体主要包括3种类型，即FcTRI、FcTRII、丰IIFcTRIII，它们义分别被称为CD64、CD32署IICDl6。FcyRI剃J激活型FcYR，其qbFcTRIA是唯一的高亲和力结合lgG单体的FcTR。其对lgG的亲和力人概为低亲和力受体F吖RIl和Fc丫Rlll的10—100倍，可在低抗体浓度下捕获免疫复合物，因此在免疫反应早期，在免疫细胞对抗原的摄入、加I：及提警方面发挥的作J}1；J远远高于其它低亲和力Fcl，R【109l。FcyRIIB为igG的低亲和力受体，是目前研究较为深入的一种抑制型受体【¨01，在生理条件下只能结合lgG复合物或多聚体，而不能结合lgG单体。段二珍等研究表明【m61，PRRSV可通过PRRSVRI性抗体gqFc1tRIIB介导增强感染PAM细胞：史平玲等【70】通过真核表达Fc^rRIll证明PRRSV和1600倍稀释抗体共同感染能够介导PRRSV抗体依赖增强作用。本试验结果也表明一定浓度的纯化的PRRS特异lgG抗体能够显著增强PRRSV感染PAM细胞；高浓度的PRRSV阴性抗体也能增强PRRSV的增殖，可能是lgG与高亲和力的FcTRI结合，选择性激活FcTRI，Fc),RI的激活可以促进病毒第23页共59页 河南农业大学2013届硕上研究生学位论文进入细胞【111】。本次试验结果显示，在病毒感染48h1L]，一定浓度的非感染性免疫复合物能明显增强PRRSV增殖。不同特性的抗体对PRRSV增殖能力各不相同，一方面与抗体自身特性有关，另一方面与结合lgGFc受体功能有关，但是否依赖唾液酸受体特性，还需要做更深入的研究。临床中，存免疫接种其它疫苗后导致PRRS病情加重的现象眦‘1131，原NN能是猪只进行免疫接种后，体内的形成的生理性免疫复合物或非特异性抗体增多，最终导致PRRS病情加重。第24页共59页 河南农业大学2013届硕：仁研究生学位论文试验二FcyRI的选择性激活在PRRSV感染的免疫反应中的作用猪繁殖与呼吸综合征(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)是二十世纪八十年代末发现的一种高度传染性疾病，引起妊娠母猪的流产、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍，以及各种年龄猪(特别是仔猪)的呼吸道疾病。PRRSV病毒属丁动脉炎病毒科、动脉炎病毒属，单股正链RNA病毒，人小约15Kb，编码9个开放阅读框。PRRSV有严格的组织嗜性，只感染血．液中PAM细胞和单核细胞，能够在宿主体内白主复制，引起猪体的免疫抑制、持续性感染和抗体依赖性增强作川等特征，造成猪场一口．污染该病后很难净化，给我国养猪业带来了极人的危害，该病己成为危害我国养猪业发展的重要疫病之一。lgGFc受体(FcTR)被认为是lgG基因超家族的成员，是免疫应答中重要的膜性调节分子，主要表达丁．NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞等，主要是通过与配体结合来发挥某些重要的生物学效应，例如参与抗原的处理和递早，抗体依赖性细胞毒作用(Antibodydependentcytotoxicity，ADCC)，细胞因子的产生，免疫应答反应和信号转导等免疫识别与清除作用。根据配体的特异性可分为lgG受体(FcTR)，lgA受体(FcaR)，IgE受体(FceR)，IgM受体(Fc“R)和IgD受体(FcSR)，目前鉴定的FcR有Fc丫RI，FcTRII，FcTRIII，boFcyRll和moFcTRIV等五个Ⅱ类。Fc),RI(CD64)是激活型FcTR，是高亲和力能够结合lgG单体的FcTR，是一种I型跨膜糖蛋白，由胞内|又：、跨膜区和3个Ig样胞外区构成。本实验室成功的从猪PAM细胞克隆出FcTRI(CD64)并制备其多克隆抗体，为本实验奠定基础。本试验首先川纯化鼠抗猪FcyRI胞外区lgG选择性激活PAM细胞FcyRl和鼠阴性lgG处理PAM细胞后接种PRRSVHn．2／06；200个TCID50的PRRSV、脂多糖(100ng／mL)、纯化鼠抗猪FcTRIlgG(550吲m1)和鼠阴性lgG(550I，tg／m1)分别处理PAM细胞，检测IFN—o【、TNF．0【mRNA水平变化和PRRSV拷贝数的变化，米研究FcTRI的选择性激活在PRRSV感染的免疫反应中的作川1材料1．1细胞株、毒株、抗体和实验动物Marc一145细胞由本实验室保存；PRRSVHn．2／06(GenBanklD：FJ556871)株为本实验窒分离并保存，由本人在Marc一145细胞上进行增殖培养，测得PRRSVHn一2／06株TCID50为105。3TCID5dmL。纯化鼠抗猪FcTRI胞外区IgG(ELISA检测抗体效价1：12800)由本实验室制备并保存；PRRSV抗原、抗体均为阴性的20日龄健康大白仔猪，购白郑州某猪场。1．2主要试剂及配制1．2．1pH7．450mmol／L的PBS缓冲液在电子天平上称取Na2HP04．12H201．4489，NaCI4．09，KH2P040．19，KCl0．19，溶于400ml双蒸水中，调节pH值至7．2—7．4，加双蒸水定容至500ml，121℃灭菌高压后，4"C保存备用。第25页共59页 河南农业大学2013届硕士研究生学位论文1．2．2细胞培养营养RPMI一1640在无菌操作台中取l袋RPMI．1640干粉溶丁．成有高压后无菌的含有800ml双蒸水的烧杯中充分搅拌至完全溶解，然后加双蒸水定容至1000ml，过滤除菌用0．221am滤膜，分装至500ml灭菌盐水瓶中，放置4"C冰箱中保存备刚。1．2．310％新生牛血清细胞生长液1640在RPMI．1640细胞培养营养液中加入10％(按照体积比加入)新生牛血清，链霉素浓度为100IU／mL，青霉素浓度为1001U／mL，4℃保存备用。1．3其它试剂ReverseTranscriptaseM-MLV、dNTPs、RibonucleaseInhibitor、Trizol、SYBRPremixExTaq等购白TaKaRa公司；RPIM1640培养基干粉购白GIBCO公司；鼠阴性lgG、新生牛血清购自郑州益康生物工程有限公司；脂多糖购买于Sigma；青、链霉素购自华北制药股份有限公司；FITC标记羊抗鼠lgG购于北京博奥森生物技术有限公司。本试验刚所到的主要材料的配制方法均参照《分子克隆实验指南第三版》[103埽l《动物病毒学》U04]。1．4主要仪器S2．93自动双重纯水蒸馏器上海弧荣sp—D乖直净化工作台蚌埠净化没备厂移液器德国Eppendorf制冰机(SIM．F124)SANYO冷冻离心机(3K30型)Sigma公司FACSCalibur流式细胞仪美国BD公司二氧化碳培养箱ThermoForma公司荧光定量PCR仪(ABl7500型)美国ABI公司6孔细胞培养板美国康!j2公司24孔细胞培养板美国康’j。公司96孔荧光定量加样板美国ABI公司2方法2．1PAM细胞的制备按照徐红运等【105】的方法获取PAM细胞。采川健康仔猪20日龄，肺脏无菌摘取，州含2000单位请链霉素的PBS液灌洗肺脏，每次注入约100mLPBS，直至倒出的PBS液清亮。将灌洗液分装无菌的离心管中，2000rmp／min离心20min，川PBS液重悬洗涤两次PAM细胞。重悬_丁．10％新生牛血清的RPMI1640中。调整细胞浓度至5×106个／ml，24孔细胞培养板中加入0．5ml／孔，6孔细胞培养板入2ml／孔，置于37"C细胞培养箱中培养约6h，弃去未贴壁的细胞，用PBS漂洗一次，加入含有新鲜10％血清RPMll640营养液，24孔细第26页共59页 河南农业大学2013届硕士研究生学位论文胞培养板中加入O．5ml／孔，6孔细胞培养板入2ml／：fL，置于37℃培养。2．2流式细胞术检测PAM表明猪FcyRI的表达收集培养36h的PAM细胞，以流式细胞术检测猪FcyRI在PAM细胞表面的表达情况，设置特异性FcyRIlgG处理组和健康鼠阴性IgG处理组。(1)PAM细胞培养36h后，取出6孔板。放置4。C内，配制含有3％FBS的PBS液(现配现用)。(2)将6孔板取出，用枪吸出孔内的液体，然后加入lml含有3％FBS，然后把板上的细胞吹打起来，待细胞完全吹打起米后刚移液枪将液体转移带Eppendorf管中，标记清楚。(3)2500rpm离一11,5min，弃上清，加入1mL3％FBSPBS液将沉淀悬浮(吹打动作要轻缓)，2500rpm离心5rain，反复洗涤3次。(4)每个Eppendorf管中加5009L一抗(1：50稀释)，4℃孵育1h(孵育期间每隔10min晃动Eppendorf管一次)。猪FcTRI一抗为纯化鼠抗FcyRIlgG胞外区和鼠阴性lgG。(5)孵育结束后，2500rpm离心5rain，弃上清向Eppendorf管内加入lmL3％FBS液，并将细胞悬浮(吹打动作要轻缓)，2500rpm离一Ii,5min。反复3次。(6)洗涤3次后每孑L加入5009L羊抗鼠F1TC标记二抗(1：100稀释)，4℃孵育1h孵育期间每隔10rain晃动Eppendorf管一次。(7)方法同(4)。(8)离一11,后的细胞川5009L含3％FBS液悬浮，4。C避光保存送检。2．3PRRSV感染PAM试验将含有200个TCID50的PRRSV接种PAM细胞，吸附1h后，弃去上清，刚含有青链霉素的PBS漂洗细胞，每孑L；011入lml。加入含有新鲜10％血清RPMll640营养液，感染12h、24h、36h、48h、60h、72h后分别收集细胞培养液，设置健康细胞。每个时间段设置三个平行。待病毒感染一定时间后取出细胞培养板，连续冻融3次后，将PAM细胞从细胞板中吹’1．-，连同细胞培养液在无菌条件卜．一起转入灭菌的1．5mLEP管中，直接进行检测或置．20。C保存备用。用段二珍‘加6】建立的Real．timeqPCR方法分别检测感染72h后PAM细胞中PRRSV拷贝数(绝对定量)；用张宜娜【¨41建立的Real—timeqPCR方法分别检测PAM细胞中IFN—n、TNF．amRNA(相对定量)转录水平。同时设健康细胞对照组。2．4LPS刺激健康PAM细胞试验将终浓度100ng／mlLPSll081处理PAM细胞，吸附lh后，弃去上清，用含有青链霉素的PBS漂洗细胞，每孔加入1ml。加入含有新鲜10％血清RPMll640营养液。作刚12h、24h、36h、48h、60h、72h后分别收集细胞培养液，收集方法同2．3，川张宜娜建立的Real．timeqPCR方法分别检PAM细胞中1FN—n、TNF一0【mRNA转录水平。2．5选择性激活Fcl,RI对健康PAM细胞中抗病毒因子转录影响第27页共59页 河南农业大学2013届硕士研究生学位论文将特异性FcyRIIgG抗体(550pg／m1)和鼠阴性lgG(550p．g／m1)处理PAM细胞，20％L／孔，同时设置健康细胞。置37"C、5％C02条件_卜．吸附lh后，取出细胞培养板，弃去上清液，用含有双抗的PBS漂洗细胞，每孑LDH*lml。然后每空加入500pL新鲜10％血清RPMll640营养液，分别培养12h、24h、36h、48h、60h、72h后收集细胞培养液，收集方法同2．3，用张宜娜建立的Real．timeqPCR方法分别检PAM细胞中IFN-旺、TNF-c【mRNA转录水平。2．6PI水SV感染选择性激活FcyRI的PAM细胞将特异性FcyRIIgG抗体和鼠阴性lgG处理PAM细胞上，200“L／孔，置37"C、5％C02条4'1：卜．作J【{J1h后，取山细胞培养板，弃之上清液川含有青链霉素的PBS漂洗细胞，每孔加入1ml。然后将含有200个TCID50的PRRSV接种处理的PAM细胞中，置37。C、5％C02条件下吸附1h后，弃去上清液，J}=fj含有双抗的PBS漂洗细胞，每孔加入1ml。感染12h、24h、36h、48h、60h、72h后分别收集细胞培养液收集方法同2．3，J}lj段二珍建立的Real．timeqPCR方法分别检测感染72h后PAM细胞中PRRSV拷贝数(绝对定量)；刚张宜娜建立的Real．timeqPCR方法分别检测PAM细胞中IFN．0【、TNF—nmRNA(相对定量)转录水平。2．7数据处理方法每个检测样品做3个平行，绝对定量所得结果，川建立的标准曲线计算PRRSV拷贝数。相对定量所得结果用2-ACT法进行计算，即AACT=(CT⋯川妒CT持家辑H)试验组．(CT¨的驻Ⅲ．CT持家酬)对照组。以13-actin为持家基冈。川GraphPadPrism5软件进行数据处理。3．结果3．1流式细胞术检测PAM细胞表面FcyRI的表达培养36h后，收集PAM细胞，川流式细胞术检测FcyRI在PAM细胞上表达情况。设置特异性FcTRIlgG抗体处理组和阴性鼠IgG处理组。结果显示：刚性组和阴性组差距显著，FcTRI在36hPAM细胞表面上表达结果是22．1％。3．2PRRSV在PAM细胞中的增殖规律PRRSV感染PAM细胞12h、24h、36h、48h、60h、72h后，利Hj已建立的PRRSV实时荧光定量PCR方法检测PRRSV感染PAM细胞后各个时间段拷贝数。如图2所示PRRSV感染PAM细胞后，12．48h期间PRRSV复制量逐渐升高，PRRSV感染48h转录达到高峰，PRRSV的拷贝数最高可达到8．30E+07，60h．72h之后PRRSV的拷贝数下降。第28页共59页 河南农业大学2013届顾}：研究生学位论文∞¨T_瞻芑蕾>山口FLI—H∞n∞芒∞>山FLl一H0‘图2-1猪FcTRI在PAM细胞上的表达Fi92—1FlowcytometryanalysisofexpressionofporcineFcyR1onthesurfaceofPAMcells．a．representativehistogramsofthemedianfluorescenceintensities(MFl)ofPAMcellssurface。stainedwithFeyRI-specificIgGandFITC-labelledgoatanti—mouseIgG．b．MFIofPAMcellssurface—stainedwithnormalmouseIgGandFITC·-labelledgoatanti·-mouselgG．∽o●_盆oU12h24hTime36h48h60h72hintsatterinteCtlon●一●n·■图2．2PAM细胞中PRRSV含量Fig．2-2．ThekineticsofviralreplicationinporcinePAMcells，viralRNAininfectedcellsfromthreeindependentexperimentswasmeasuredbyquantificationRT-PCR．ErrorbarsindicatetheSEM·3．2PRRSV和LPS对PAM中的抗病毒细胞因子转录的影响第29页共59页《Z√H旨>∽岛岛厶卧。厂I 河南农业大学2013届硕：L研究生学位论文鲁约量d量号宙50昌5生函-一0a圆Mock口PRRSV四LPS12h24h36h48h601172hTimepointsafterinfectionb臣墨№ckm．aPRRSV区，LPS●奉●12h24h36h48h60h72hTimepointsafterinfection图2-3PRRSV感染细胞、LPS处理细胞、健康细胞IFN．n、TNF．旺mRNA转录水平变化Figure2-3ThecytokinesmRNAlevelsinPRRSVinfectedcellsorLPSstimulatedcellsormocknormalcellsweremeasuredbyrelativequantificationRT-PCR．Barsindicatethe2-ACTofcytokinesmRNAcopiesininfectedcellsormockcells±SEMfromthreeindependentexperiments．+++P<0．001，++P<0．01，+P<0．05．(a)IFN—QmRNALevels；(b)TNF-QmRNAlevels利用已建立的IFN．n、TNF—u相对荧光定量PCR方法(以13-actin为内参基I灭1)检测PRRSV感染的PAM细胞、LPS处理PAM细胞和健康PAM细胞。12h、24h、36h、48h、60h和72h不同处理组不同时间段IFN—c【、TNF—Q的mRNA转录水平进行检测。结果如图3所示：LPS处理组IFN—c【、TNF．u的mRNA水平与健康细胞相比均上调。PRRSV组IFN．c【mRNA水平与健康细胞相比，在12h、24h期间均明显提高，上调1．75倍和1．37倍，36h一60h显著I-I洚-，卜．降0．57．0．39倍，72h时下降O．78倍。说明PRRSV前期促进PAM细胞IFN．QmRNA的转录，后期抑制PAM细胞IFN．0【mRNA的转录。PRRSV组TNF．umRNA水平与健康细胞相比，12h．72h期间均F降，卜．降0．19-0．88倍，在60h‘1-降显著，其他时间段略微下降。3．2选择性激活FcTRI对健康PAM细胞中细胞因子转录水平的影响第30页共59页凶着Iu矗；IDa^霉叠。鬣8l-函乙一 河南农业大学2013届硕士研究生学位论文a固Mock回／mli-lqrRl蜘皿NegativelgGb四Mock口AⅡ嘶砌lgG口Nega6wtgC12h241136h48h60h72hTimepointsaftertreatment12h24h36h48h60h72hTimepointsaftertreatment图2-4选择性激活FcyRI和阴性lgG诱导IFN．Ⅱ、TNF一ⅡmRNA转录水平变化Fig．2-4．EffectofFcYRIonmRNAexpressionofcytokinesinporcinePAMcells，cytokinesmRNAlevelsincellspretreatedwithFe,／RI-specificlgGorcellspretreatedwithhealthymouselgG(negativeIgG)ornormalcellsweremeasuredbyrelativequantificationRT-PCR．Barsindicatethe2-ACTofcytokinesmRNAcopiesininfectedcellsormockcells4-SEMfromthreeindependentexperiments．+++P<0．001．++P<0．01，+P<0．05．(a)IFN-amRNALevels；(b)’rf、JF-QmRNAlevels以13-actin作为内参基冈，应用己建立的IFN．u、TNF—cc相对荧光定量PCR检测方法，分别检测纯化FcTRIIgG选择性激活PAM和鼠阴性lgG处理PAM细胞中IFN—u和TNF一。【在12h、24h、36h、48h、60h和72h各处理方法和各时间段内的mRNA转录水平。结果如图4所示：特异性FcTRllgG选择性激活PAM后，1FN—a和TNF．umRNA水平与健康细胞相比均显著下降。1FN．umRNA水平下降0．14．0．25倍，48h转录水平最低，TNF．umRNA下降0．13—0．32倍12h转录水平最低；鼠阴性IgG处理PAM细胞IFN一Ⅱ和TNF一伐mRNA水平与健康细胞相比变化不人。这些数据显示选择性激活猪FcTRl能够抑制宿主细胞的先天抗病毒反应。3．3选择性激活FcTRI后PRRSV对PAM中的抗病毒细胞因子转录利用已经建立IFN—Q、TNF．n实时荧光定量(相对荧光定量)PCR方法(以13-actin为内参基因)检测选择性激活FcTRI和鼠阴性lgG处理PAM细胞后PRRSV感染的PAM细胞，后12h、24h、36h、48h、60h和72h的IFN．Q利TNF．。【的mRNA转录水平进行检测。结果如图5所示。FcTRIlgG选择性激活PAM后感染PRRSV，与PRRSV感染PAM细胞组相比，IFN．0【mRNA转录在12h一72h期间显著卜．降，卜．降0．05倍-0．3l倍；TNF—c【的mRNA转录在12h．60h期间显著_卜．降，下降0．14倍．0．57倍，72h使TNF．0【的mRNA转录相差不大。鼠阴性IgG处理PAM细胞后PRRSV与PRRSV感染PAM细胞组相比，IFN·0【第31页共59页0O0金11_口詈O掣每叠舆笛子．函Z一釜薯_墨_9皇壹BIo筐警之区一 河南农业大学2013届硕-J：：『iJf究生学位论文和TNF—u的mRNA转录水平相差不人。这些骜a12h24h36h髓h60h72hTimepointsafterinfection口PRRSVb囡PRl塔V+Anli-FcyRI龟G12h24h36h钙h60h72hTimepointsafterinfection图2-5选择性激活FcyR!和鼠阴性lgG处理PAM细胞后PRRSV诱导IFN—n、TNF-amRNA转录水平变化Fig．2-5．EffectofFcyRlonmRNAexpressionofcytokinesinducedbyPRRSVinporcinePAMcells，cytokinesmRNAlevelsinPRRSVinfectedcellspretreatedwithFcyRI·specificlgGorcellspretreatedwithhealthymouselgG(negativelgG)orPRRSVinfectedcellsweremeasuredbyrelativequantificationRT·PeR．Barsindicatethe2-ACTofcytokinesmRNAcopiesininfectedcellsormockcells士SEMfromthreeindependentexperiments．料+P<0．001．++P<0．01．+P<0．05．falI}’N-QmRNALevels：fbllNF-cEmRNAlevels．鼠阴性lgG处理PAM细胞后PRRSV感染的PAM细胞，后12h、24h、36h、48h、60h和72h的PRRSVmRNA变化水平进行检测。结果如图6所示。FcyRIlgG选择性激活PAM后感染PRRSV，与PRRSV感染PAM细胞组相比，12h．36h期间PRRSV的拷贝数显蒋提高，提高16．6．119．8倍，60h稍微卜．降，但不明显。鼠阴性IgG处理PAM细胞后PRRSV与PRRSV感染PAM细胞组相比变化不火。这些数据显示选择性激活FcyRI后，FcyRI能够促进PRRSV在PAM细胞中增殖。第32页共59页占．I葛詈d∞>留墨。筐8．函Z一扫薯_霉_d∞≯驾爵la筐苎．乙自 河南农业大学2013届硕士研究生学位论文口PRRSV口置PRRSV+Anti-FqRIIgG12h24h36h48h60h72h7”。pointsafterinfecti01lineoointsaltermiecUon图2-6选择性激活FcTRI后PRRSV增值规律Fig．2-6．EffectofFcTRIonviralreplicationinporcinePAMcells，viralRNAinPRRSVinfectedcellspretreatedwithFcTRI—specificlgGcellspretreatedwithhealthymouselgG(negativelgG)orPRRSVinfectedcellsfromthreeindependentexperimentsweremeasuredbyquantificationRT-PCR．ErrorbarsindicatetheSEM．+++P
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