fcγr ⅰ在prrsv-ade作用中的研究及lps对prrsv感染的影响

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1、河南农业大学硕士学位论文FcγRⅠ在PRRSV--ADE作用中的研究及LPS对PRRSV感染的影响姓名：周永辉申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：夏平安201206河南农业大学2012届硕士研究生学位论文摘要猪繁殖与呼吸综合征(PRltS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染引起的一种猪的病毒性传染病。本试验通过研究IgG单体在PRRSV侵染PAM细胞的过程中的作用，为探讨＆佩I在PRRSV感染中的作用机制奠定基础。PRRSV感染后往往弓I起副猪嗜血杆菌等革兰氏碉性细菌继发感染，本试验初步研究了LPS对PRRSV

2、感染的影响，为更加深入的探讨—恻Ⅳ与细蔼混合感染的致病机制奠定基础。本研究从健康猪肺收集PAM细胞，提取总RNA，设计一对F；cI峨I胞外区(除去信号肽)的特异性引物Fy。用RT-PCR方法扩增出其基因片段，大小约为S22bp，将这基因片段亚克麈到pET-32a载体中，构建重组表达质粒pET-FY。在IPTG的诱导下成功表达，获得了分子量大小约为47．2KD的重组蛋白FY，与预期的蛋白分子量相符：通过优化表达条件，大量表达重组蛋白，用尿素法对表达的蛋白进行纯化与复性。用纯化蛋白免疫小鼠，制备抗重组蛋白FY的多克隆抗体，经阔接EL

3、ISA检测，效价为l：12800，并做免疫印迹试验，结果显示制备的多抗可以与各自的重组蛋白特异性结合，表明表达的重组蛋白具有较好的免疫原性。本研究用纯化的兔IgG(3．0mgmL)经皮下免疫猪，每头2．2mL，用琼脂扩散试验检测血清中抗兔l掣G抗体效价，待抗体效价达到1：32时鼻腔接种PRRSV，接种后4d、6d，蜘、13d、17d、2∞、23d、26d，39d、47d、51d分别采集血液样品制备血清，用荧光定量RT-PCR方法检测PRRS34病毒核酸，并用ELISA方法检测抗脚llt．SV抗体效价，结果显示，免疫感染组猪感染后

4、4-39天均可在血清中检测到PRRSV核酸，而接毒对照组则只在4-26d天检测到病毒核酸，免疫感染组病毒血症比感染对照组持续时问延长8天，且免疫感染组在4d、6d、9d、13d、17d，23d、26d、39d时PRRSVmRNA水平均较接毒对照组略微升高。免疫组血清ELISA抗体检测在9d、13d、17d、23d均为PRRSV抗体阳性，阳性抗体在体内维持15天；接毒对照组廊-清ELISA抗体检测在6d、蚰、13d、17d均为阳性，阳性抗体在体内维持12天；其中在13d和17d时免疫组血清抗体效价较接毒对照组稍高，以上结果说明猪·

5、。体内珂cR：SV非特异性lgG

6、能促进病毒感染。本研究通过先将终浓度为1．30mg／mL的PRRSV阴性健康猪lgG于37"(2处理删I-M细胞12h后，再将100个TCIDso的PRRSV病毒液0．2mL接种PAM细胞，并设接毒对照组，通过荧光定量RT-PCR方法分别测定感染后12h、2411、36h、4811PRRSV拷贝数变化，结果显示，PRRSV阴性健康猪IgG处理组PRRSV在各时间段拷贝数均较接毒对照组显著提高，其中12h最高，拷贝数是对照组的11．7倍，48h最低，是对照组的3．5倍，说明PRRSV非特异性猪lg

7、G经FcyRl促进PRRSV在PAM细胞中的复制。本试验通过将鼠抗猪脚RI胞外区重组蛋白多抗加入PAM细胞作用lh后接种PRRSV，分别培养12h、24h、36h、48h后，收集细胞及上清，同时鼠阴性血清加入PAM细胞作用lh后接种PRRSV作为对照，用real-timePCR方法检测PAM细胞中病毒拷贝数，第1页共59页河南农业大学2012届硕士研究生学位论文结果显示，各时间段鼠抗猪聊RI胞外区重组蛋白多抗处理试验组PRRSV拷贝数与阴性血清处理组相比各时间段均增高，其中24h最高升高6．3倍。本研究通过将鼠抗猪Fc-／RI胞

8、外区重组蛋白多抗加入PAM细胞作用lh后分别培养12h、24h、36h、48h，．收集细胞及上清，同时做鼠阴性血清处理组和健康细胞对照组，用real-timePCR方法检测PAM细胞中IFN-n、n旺吨、IL-10mRNA水平。结果显示，特异性抗体处理试验组与阴性血清处理对照组相比12h、24h、36h、48hIFN．-(ImRNA水平均升高，其中12h最多升高3．9倍；特异性抗体处理试验组与阴性血清对照组相比，TNF-amRNA水平各时间段均升高，其中12h、24h显著升高；特异性抗体处理试验组与阴性血清处理对照组相比，lL．

9、10mRNA转录水平各时间段均显著降低。以上试验说明PAM细胞内激活F艰I能够促进IFN．-u、TNF吨mRNA的转录，而抑制IL．10mRNA转录，由此推测PRRSV感染前期通过FcYRI介导的PAM细胞吞噬作用促进病毒增殖，后期抗病毒因子发挥抑制病毒增殖作用