不同型cpg+odns对猪源细胞的免疫调节效应

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1、不同型CpGODNs对猪源细胞的免疫调节效应ImmunoregulatoryEffectsofDifferentCpGOligodeoxynucleotidesonPorcineCells学科专业：生物学研究生：邓慧指导教师：黄金海教授天津大学生命科学学院二零一七年五月万方数据独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得天津大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工

2、作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津大学有关保留、使用学位论文的规定。特授权天津大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。（保密的学位论文在解密后适用本授权说明）学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日万方数据摘要免疫佐剂是一类可以增强抗原免疫原性的免疫

3、调节分子、化合物或大分子复合物。大多数佐剂可以通过启动先天免疫系统来辅助抗原应答。先天免疫系统通过模式识别受体（patternrecognitionreceptor，PRR）来感知各种微生物表达的病原体相关分子模式（pathogen-associatedmolecularpatterns，PAMPs）的存在，激活对病原体的先天性免疫信号通路并调节适应性免疫应答。添加天然或人工合成的佐剂分子有助于恢复或改进纯化抗原的免疫原性，调节免疫应答类型，在现代疫苗学研究中具有重要意义。含CpG序列的寡脱氧核苷酸（oligo

4、nucleotide，ODN）可模拟哺乳动物免疫系统的“危险信号”，参与机体免疫应答的调节，增强疫苗的免疫原性。为了研究包含CpG基序的寡聚核苷酸对猪的免疫调节作用，本论文设计并合成了11条不同的CpGODNs，完成了3D结构模拟及内能分析；应用3种猪源细胞（猪小肠上皮细胞（IPEC-J2），猪肺泡巨噬细胞（3D4/21），猪外周血单核细胞（PBMCs））建立CpGODNs处理模型，从胞内TLRs、信号通路分子、细胞因子（白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子等）、抗原提呈相关分子的转录水平变化等评价11条CpGOD

5、Ns对体外处理细胞的免疫调节作用；检测了不同CpGODNs处理细胞诱导干扰素产生的能力及其抗病毒效应。主要结果如下：（1）猪免疫调节CpGODNs基序的设计及分析：对小鼠、人及现有多种动物的CpGODNs的不同类型基序及其功能的比较分析，通过CpG基序、侧翼、末端序列基序的选择，硫酯键替代磷酯键，设计合成了对猪具有潜在免疫调节作用的11条不同型CpGODNs序列，应用Chemoffice2015模拟3D结构，选择最小内能法，绘制了稳定的3D结构图。（2）CpGODNs基序对猪源细胞系的免疫调节作用：CpGODN

6、s主要活化以下四条信号通路：TLR9-MyD88-NF-κB、TLR9-MyD88-MARKp38、TLR3-NF-κB、TLR3-IRF3，促进多种白介素及炎性因子转录（Th1型细胞因子IL-12，IFN-γ；Th2型细胞因子IL-4；局部免疫因子IL-17等），调节细胞的免疫应答类型，平衡Th1/Th2反应：CpG1,CpG2,CpG7,CpG9,CpG10,CpG11促进多种细胞因子表达，CpG3,CpG4,CpG6可以作为潜在的猪Th1/Th2特异性诱生剂促进IL-4和IFN-γ的表达，CpG5,CpG

7、8可作为Th2型免疫反应特异性诱生剂促进IL-4的表达，CpG4可作为Th1型免疫反应特异性诱生剂促进IFN-γ的表达。CpGODNs可以增强抗原提呈能力，促进3D4/21和PBMCs粘附分子CD86表达升高，CpG1,I万方数据CpG8,CpG9,CpG11可通过增强MHC分子的表达促进专职APC的抗原提呈能力；除去CpG3其余CpGODNs可以作为猪IFN-γ的诱生剂，其中CpG1,CpG6,CpG7,CpG8,CpG11可作为特异型活化Ⅰ型干扰素的序列；并且CpGODNs的免疫调节作用具有细胞依赖性。（3

8、）不同CpGODNs基序的抗病毒效应：应用猪流行性腹泻病毒（PEDV）、GFP标记的水泡性口炎病毒（VSV-GFP）研究了CpGODNs处理IPEC-J2细胞后抗病毒能力的变化。CpGODNs抗病毒及诱发IFNβ/α的能力因CpGODNs类型、结构而异。CpGODNs表现出明显优于非CpG序列的抗病毒效应。检测了11条CpGODNs协助IPEC-J2细胞抵抗病毒的能力：抗PEDV的能力