稳定表达突变和野生型tdp43的运动神经元样细胞兴奋性升高以及双甲氧姜黄素的神经保护作用

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1、河北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师(或指导小组)的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文，第一署名单位为河北医科大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权归河北医科大学所有。否则，承担相应的法律责任。研究生签名：王心毒甲师签章：、7矿√傺f二级学院签2013研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注等内容外，文中不包括其他人已经发表或撰写的研究成果，指

2、导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。研究生签名：王小翻刷稚章．j降20I弓年弓月刁日目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5研究论文稳定表达突变和野生型TDP43的运动神经元样细胞兴奋性升高以及双甲氧姜黄素的神经保护作用前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯100日U舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯12结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．17附图⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯22讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯35参考文献⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．36综述TDP43与ALS⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯39致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯47个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯48中文摘要稳定表达突变和野生型TDP43的运动神经元样细胞兴奋性升高以及双甲氧姜黄素的神经保护作用摘要TDP43由人类TARDBP基因编码产生。人类TARDB

4、P基因位于1号染色体短臂3区6带上，并且编码414个氨基酸残基组成的蛋白质，分子量大约43kDa即TDP43。近几年，在部分额颞叶痴呆(FTLD．U)和肌萎缩侧索硬化(ALS)患者的病理研究中发现泛素阳性的包涵体，而TDP43是这种包涵体的主要组成部分。TDP43主要位于细胞核中，并且在细胞核和细胞质中穿梭。参与到RNA运输、翻译、维持稳定性、降解等多个环节。但是在部分ALS和FTLD．U患者的中枢神经系统中，TDP43由细胞核转移到了细胞质内聚集，并且被泛素化、磷酸化且部分是以剪切的片段形式存在。TDP43基因很有可能是继SODl基因后发现的引起ALS的又一高突

5、变基因。携带SODl突变基因的小鼠在出现临床症状前就已经表现出运动神经元的高兴奋性。神经元的高兴奋性可能促进能量代谢，增加ATP消耗，加重线粒体负担，最终导致能量耗竭，推进临床症状的发展。然而表达突变和野生型TDP43蛋白的运动神经元样细胞的兴奋性水平还不清楚。目前对TDP43基因与ALS之间关系的研究越来越多，有研究显示在NSC34细胞中，野生型和突变的TDP43基因可以导致线粒体形态异常，线粒体复合物1的下调和线粒体膜电位丢失和线粒体内膜解偶联蛋白2(UCP2)表达水平的升高，同时有研究表明双甲氧姜黄素可以下调UCP2的表达提高线粒体跨膜电势，改善线粒体复合物

6、．1的活动和线粒体的形态，进而保护神经元。此外，我们实验室前期的研究显示，姜黄素的类似物双甲氧姜黄素(DimethoxyCurcumin，DMC)，可以改善自噬体和溶酶体的融合障碍，增强自噬性清除毒性蛋白的能力。但是给予DMC后，表达突变和野生型TDP43蛋白的运动神经元样细胞的兴奋性水平是否有改变，我们仍然不清楚。目的：研究稳定表达突变TDP43蛋白(Q331和野生型TDP43蛋白的运动神经元样细胞动作电位的特性，推测兴奋性水平；以及给予双甲氧姜黄素后，细胞动作电位的特性是否改变，分析TDP43蛋白在ALS发病中文摘要机制中的作用。方法：本实验选用稳定转染Emp

7、tyvector、TDP43Widetype、TDP43Q331K三个NSC34细胞系。这三种细胞系由本实验室构建，采用脂质体将三种不同的TDP43基因转入NSC34细胞。参考NSC34细胞系的方法进行培养，采用免疫细胞化学方法进行鉴定TDP43表达。采用全细胞膜片钳技术，通过记录这三种细胞的动作电位，研究这三种细胞在潜伏期，阈电位，幅度及动作电位频率方面的情况，并观察这些指标在给予双甲氧姜黄素后的变化。结果：1给药前Empty组、WT组、Q331K组这三组细胞组间动作电位特性比较与转染空质粒的NSC34细胞(Empty组)相比，转染野生型TDP43基因的NSC3

8、4细胞(W